تعیین عوامل باکتریایی موجود در پوسته و زرده تخم‌مرغ‌های با پوسته آلوده و تمیز عرضه‌شده در تبریز

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه پاتوبیولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز، تبریز، ایران

2 دانش‌آموخته دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز، تبریز، ایران.

چکیده

بیماری‌های مشترک باکتریایی جزو مهم‌ترین بیماری‌های عفونی انسان محسوب می‌شوند. در این بین بیماری‌های قابل‌انتقال از غذا دارای اهمیت ویژه‌ای هستند. از بین مواد غذایی با منشأ دامی، تخم‌مرغ به‌دلیل نوع استفاده در محصولات غذایی مانند سس‌ها، چاشنی‌های غذایی، بستنی و انواع غذاها که ممکن است به‌صورت خام یا نیم‌پز مورد استفاده قرار گیرد همواره می‌تواند به‌صورت بالقوه منشأ آلودگی و انتقال بیماری‌ها به انسان باشد. در این پژوهش با مراجعه به مرغداری‌های اطراف تبریز با نمونه‌برداری از تولیدات روزانه، تعداد 120 عدد تخم‌مرغ انتخاب و در شرایط کاملاً استریل به آزمایشگاه منتقل شدند. بعد از انجام مراحل کشت (استفاده از محیط‌های کشت برین هارت براث، برین هارت آگار، بلاد آگار، آبگوشت تتراتیوات، آبگوشت سلنیتF، آبگوشت تیو گلیکولات، XLD آگار، سالمونلا شیگلا آگار و...) رنگ‌آمیزی گرم، تست‌های اکسیداز و کاتالاز، باکتری‌های موجود بر روی پوسته و داخل زرده جداسازی و مورد شناسایی قرار گرفت. از بین 120 نمونۀ مورد بررسی، در
19 مورد(٪83/15)  آلودگی زرده به اثبات رسید. از این تعداد %68/73 را گرم منفی‌ها و %31/26 را گرم مثبت‌ها شامل می‌شدند. بیشترین سهم گرم منفی‌های زرده به سودوموناس با فراوانی %3/8 وگرم مثبت‌ها باسیلوس با فراوانی %16/4 تعلق داشت. همچنین از نمونه‌های اخذشده از پوسته 119 مورد از 120 نمونۀ پوسته دارای آلودگی‌های باکتریایی بودند که %16/99 کل نمونه‌ها را تشکیل می‌داد. از این میان %55/ 23 نمونه‌ها گرم منفی و % 44/76 گرم مثبت بودند. بیشترین سهم گرم منفی‌های پوسته مربوط به جنس سودوموناس با فراوانی %33/18 در کل پوسته‌ها بود، اشریشیا با %83/10، پروتئوس با %83/5 و سیتروباکتر با %16/4 در رتبه‌های بعدی قرار داشتند. از میان گرم مثبت‌های جداشده از پوسته بیشترین سهم متعلق به باسیلوس با فراوانی %80 بود و استافیلوکوک با %16/34، استرپتوکوک با %15، رودوکوک با %16/9 و میکروکوک با %5/7  در رتبه‌های بعدی قرار داشتند. براساس نتایج حاصله از این تحقیق می­توان گفت که استفاده و مصرف تخم‌مرغ‌های با پوسته کثیف در محصولات غذایی یک ریسک جدی برای سلامت انسان محسوب می‌شود و می‌تواند منجر به ایجاد بیماری‌های غذازاد باکتریایی شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

A comparative study of bacterial agents in eggs, with or without eggshell's contamination that produced in Tabriz.

نویسندگان [English]

  • M Khakpoor 1
  • M Bozorgnia 2
1 Department of pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine , Tabriz Branch, Islamic Azad University, Tabriz, Iran
2 Ggraduated of Veterinary Medicine, Tabriz Branch, Islamic Azad University, Tabriz, Iran.
چکیده [English]

Zoonotic bacterial diseases are considered as the most important human infectious diseases. In this category, a disease that transfer and infect human through food has an special role. Among foods with animal origin, eggs due to their application as food ingredient in food products, like sauces, spices, ice creams and other food products that may use in half cooked or crude forms, always has the potential to transfer microbial pathogens to human. This study is about to prove that presence of remainder feces on eggshells leads the penetration of bacterial agents into egg yolk. A total of 120 daily egg samples (with and without fecal contamination) were collected from henneries around Tabriz and transferred immediately to microbiology laboratory. After performing microbial examinations (using BHI Broth, BHI Agar, Blood Agar, Selenite F, Tetrationate, XLD,SS Agar),Gram Staining, Oxidase and Catalase tests, bacteria of eggshells and egg yolks has been identified. Out of 120 eggs, 15.83% bacterial contaminants were found in egg yolks samples. Among them, 73.68%  were gram negative and 26.31% were gram positive. Among gram negatives, Pseudomonas with occurrence of 8.3% and in gram positives group, Bacillus with abundance of  4.16% were the most frequent bacterias. Also in samples collected from eggshells, 99.16% of the eggs demonstrated bacterial contamination which 23.55% of positive samples were among gram negative group and 76.44% were gram positive. The most contribution of eggshell gram negative bacterias were relevant to Pseudomonas, E.coli, Proteus and Citrobacter with respectively 18.33%,10.83%,5.83% and 4.16% rations. Among gram positive bacteria that isolates form eggshell samples for the most frequent bacterias, were Bacillus, Staphylococccus, Streptococcus, Rhodococcus and Micrococcus with respectively 80.00%, 34.16%, 15%, 9.16% and 7.5% rations. Use and consumption of eggs with shells contaminated with faces in food products is a serious risk factor for human health and can lead to zoonotic bacterial diseases by transferring bacterial pathogens.

کلیدواژه‌ها [English]

  • bacterial contamination
  • egg
  • Eggshell
  • Egg yolk

 

تعیین عوامل باکتریایی موجود در پوسته و زرده تخم‌مرغ‌های با پوسته آلوده

و تمیز عرضه‌شده در تبریز

 

منصور خاکپور1*، مجتبی بزرگ‌نیا2

 

1- گروه پاتوبیولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز، تبریز، ایران.

2- دانش‌آموخته دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز، تبریز، ایران.

*نویسنده مسئول مکاتبات:  khakpour@iaut.ac.ir

(دریافت مقاله:  24/1/90   پذیرش نهایی: 31/4/90)

 

 

چکیده

بیماری‌های مشترک باکتریایی جزو مهم‌ترین بیماری‌های عفونی انسان محسوب می‌شوند. در این بین بیماری‌های قابل‌انتقال از غذا دارای اهمیت ویژه‌ای هستند. از بین مواد غذایی با منشأ دامی، تخم‌مرغ به‌دلیل نوع استفاده در محصولات غذایی مانند سس‌ها، چاشنی‌های غذایی، بستنی و انواع غذاها که ممکن است به‌صورت خام یا نیم‌پز مورد استفاده قرار گیرد همواره می‌تواند به‌صورت بالقوه منشأ آلودگی و انتقال بیماری‌ها به انسان باشد. در این پژوهش با مراجعه به مرغداری‌های اطراف تبریز با نمونه‌برداری از تولیدات روزانه، تعداد 120 عدد تخم‌مرغ انتخاب و در شرایط کاملاً استریل به آزمایشگاه منتقل شدند. بعد از انجام مراحل کشت (استفاده از محیط‌های کشت برین هارت براث، برین هارت آگار، بلاد آگار، آبگوشت تتراتیوات، آبگوشت سلنیتF، آبگوشت تیو گلیکولات، XLD آگار، سالمونلا شیگلا آگار و...) رنگ‌آمیزی گرم، تست‌های اکسیداز و کاتالاز، باکتری‌های موجود بر روی پوسته و داخل زرده جداسازی و مورد شناسایی قرار گرفت. از بین 120 نمونۀ مورد بررسی، در
19 مورد(٪83/15)  آلودگی زرده به اثبات رسید. از این تعداد %68/73 را گرم منفی‌ها و %31/26 را گرم مثبت‌ها شامل می‌شدند. بیشترین سهم گرم منفی‌های زرده به سودوموناس با فراوانی %3/8 وگرم مثبت‌ها باسیلوس با فراوانی %16/4 تعلق داشت. همچنین از نمونه‌های اخذشده از پوسته 119 مورد از 120 نمونۀ پوسته دارای آلودگی‌های باکتریایی بودند که %16/99 کل نمونه‌ها را تشکیل می‌داد. از این میان %55/ 23 نمونه‌ها گرم منفی و % 44/76 گرم مثبت بودند. بیشترین سهم گرم منفی‌های پوسته مربوط به جنس سودوموناس با فراوانی %33/18 در کل پوسته‌ها بود، اشریشیا با %83/10، پروتئوس با %83/5 و سیتروباکتر با %16/4 در رتبه‌های بعدی قرار داشتند. از میان گرم مثبت‌های جداشده از پوسته بیشترین سهم متعلق به باسیلوس با فراوانی %80 بود و استافیلوکوک با %16/34، استرپتوکوک با %15، رودوکوک با %16/9 و میکروکوک با %5/7  در رتبه‌های بعدی قرار داشتند. براساس نتایج حاصله از این تحقیق می­توان گفت که استفاده و مصرف تخم‌مرغ‌های با پوسته کثیف در محصولات غذایی یک ریسک جدی برای سلامت انسان محسوب می‌شود و می‌تواند منجر به ایجاد بیماری‌های غذازاد باکتریایی شود.

 

واژه‌های کلیدی: عوامل باکتریایی، تخم‌مرغ، پوسته، زرده

 


مقدمه

بیماری‌های زئونوز باکتریایی از با اهمیت‌ترین بیماری‌های عفونی می‌باشند (Tabatabayi, 2001) به‌طوری‌که سه بیماری سالمونلوز، سل و بروسلوز مهم‌ترین معضل عفونی جوامع انسانی محسوب می‌شوند (Quinn, 2002 ).

در بین بیماری‌های زئونوز بیماری‌های منتقله از غذا از اهمیت ویژه‌ای از نظر بهداشت عمومی برخوردار می‌باشند به‌طوری‌که امروزه با توجه به معضل افزایش بیماری‌های نوپدید و بازپدید مثل سل، بروسلوز، آنفولانزا و ویبریوها که اغلب توسط مواد غذایی به انسان انتقال پیدا می‌کنند لزوم ایجاد همکاری حرفه‌ای مابین پزشکان و دامپزشکان جهت ارتقاء سطح سلامت جامعه، بیش از پیش احساس می‌شود (Tabatabayi, 2001). از بین مواد غذایی با منشأ دامی تخم‌مرغ به‌دلیل نوع استفاده در تولیدات غذایی مانند: سس‌ها، چاشنی‌های غذایی، بستنی و انواع غذاها که ممکن است به‌صورت خام و یا نیم‌پز مورد استفاده قرار گیرد، همواره می‌تواند به‌صورت بالقوه منشأ آلودگی و انتقال بیماری‌ها به انسان باشد (March, 1969). به‌طوری‌که امروزه مطالعات گسترده‌ای در این زمینه صورت می‌گیرد و برخی عوامل عفونی باکتریایی نظیر: سالمونلا، کمپیلوباکتر، یرسینیا و ... اغلب از طریق تخم‌مرغ آلوده به انسان منتقل می‌شود که به‌عنوان یک مشکل بهداشتی حتی در جوامع پیشرفته محسوب می‌شود (Favier, 2008) به‌طوری‌که در دهه 80 شیوع بالای سالمونلوز در انگلستان باعث شد تا در یک دوره زمانی مصرف تخم‌مرغ در این کشور ممنوع اعلام
شود (Tabatabayi, 2001). از سوی دیگر مطالعات گسترده در زمینه کاهش آلودگی‌های تخم‌مرغ از طریق استفاده از مواد ضدعفونی‌کننده، پرتو فرابنفش، پرتو گاما و روش‌های حرارتی نشان‌دهنده اهمیت موضوع می‌باشد (De Reu, 2005; Favier, 2008).

با توجه به موارد فوق شناسایی عوامل باکتریایی موجود در تخم‌مرغ‌های عرضه‌شده به بازار از یک طرف می‌تواند امکان تدوین یک برنامه اصولی و مدون در کنترل و پیشگیری بیماری‌های ناشی از این مواد غذایی را فراهم کند و از طرف دیگر می‌تواند محکی باشد بر برنامه‌هایی که در مؤسسات تولید و عرضه تخم‌مرغ در جهت کاهش آلودگی‌ها صورت می‌گیرد.

پژوهش حاضر در نظر دارد نوع عوامل باکتریایی موجود در تخم‌مرغ‌های عرضه ‌شده در بازار تبریز را که به مدفوع آلوده هستند شناسایی و در کنارآن مقایسه‌ای با آلودگی‌های تخم‌مرغ‌های تمیز انجام دهد.

 

مواد و روش­ها

در این مطالعه با مراجعه به 3 مرکز تولیدکننده تخم‌مرغ که محصولات آن روانه بازار تبریز می گردد، با نمونه‌برداری از تولیدات روزانه اعم ازتخم‌مرغ‌های آلوده به مدفوع و پاک، تعداد 120 عدد تخم‌مرغ جمع‌آوری گردید. بدین‌ترتیب که از هر شانه تخم‌مرغ که حاوی تخم‌مرغ‌های آلوده بودند به‌صورت جداگانه در شرایط استریل تخم‌مرغ‌ها برداشته و بعد از قرار دادن آنها در کیسه‌های نایلونی در بسته استریل، در کوتاه‌ترین زمان ممکن به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحدتبریز ارسال گردید. ضمناً از هر کدام از شانه‌های حاوی تخم‌مرغ آلوده، تعداد 2 عدد تخم‌مرغ سالم به‌عنوان شاهد به همان روش به آزمایشگاه منتقل شد.

در آزمایشگاه هر بار تعداد مشخصی تخم‏مرغ تحت آزمایش قرار ‏گرفت بدین‌صورت که پس ازانتقال تخم‌مرغ‌ها به آزمایشگاه، در شرایط استریل در کنار شعله، تخم‌مرغ‌ها از کیسه استریل خارج گردید. با کشیدن سوآب آغشته به سرم فیزیولوژی استریل برروی پوسته تخم‌مرغ‌ها، از آنها نمونه‌ تهیه و به محیط برین هارت براث (آبگوشت قلب و مغز گوساله) به‌منظور غنی‌سازی انتقال  داده شد، بعد از نمونه‌برداری از پوسته، تخم‌مرغ‌ها به‌صورت جداگانه به‌منظور ضدعفونی در داخل بشرهای استریل حاوی الکل 70 % که قبل از شروع آزمایش آماده شده بود قرار گرفتند به‌نحوی که آسیبی به پوسته آن وارد نشود. تخم‌مرغ‌ها به‌مدت 1 ساعت در این شرایط رها  شدند تا با ضدعفونی کامل پوسته احتمال آلودگی به هنگام شکستن پوسته و نمونه‌برداری از زرده به حداقل برسد. برای تهیه نمونه از زرده  تخم‏مرغ به ‌ترتیب زیر عمل ‏شد:

تخم‏مرغ ها از درون بشر  بیرون آورده شده و برای جلوگیری از ورود الکل به داخل محتویات تخم‏مرغ در هنگام شکستن، سطح تخم‏مرغ  با تامپون استریل به‌خوبی خشک گردید و در کنار شعله چراغ الکلی و به کمک یک پنس‌ استریل پوسته تخم‏مرغ شکسته شده سپس به کمک یک سمپلر با سر سمپلر استریل مقدار
1 سی‌سی از زرده نمونه‌برداری  و به 2 محیط برین هارت براث و تیوگلیکولات انتقال داده شد. (لازم به ذکر است که برین هارت براث بعد از انتقال زرده با لرزاننده (Shaker) کاملا مخلوط هم زده شد). برین هارت براث‌های کشت داده شده از زرده و پوسته برای 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس
گرم­خانه‌گذاری شدند.

سپس، محیط‌های غنی‌سازی برین هارت براث کشت‌شده با نمونه‌های پوسته و زرده، جهت بررسی شواهد رشد باکتری در آن مورد بازرسی قرار گرفتند، در ادامه کار در صورت مشاهده رشد باکتری با نشانه ایجاد کدورت در محیط، 2 مسیر مورد پی‌گیری قرار گرفت:

1- در مسیر اول، بعد از نمونه‌برداری از محیط غنی‌سازی با آنس استریل در محیط بلادآگار به‌صورت خطی کشت داده شد و به‌مدت 24 ساعت در انکوباتور گرم‌خانه‌گذاری گردید. بعد از سپری شدن این مدت کلنی‌های رشدیافته بر روی این محیط بررسی گردیدند. در صورت رؤیت بیش از یک نوع کلنی بر روی محیط، اقدام به انجام کشت خالص‌سازی گردید بدین‌صورت که با استفاده از یک آنس استریل از هر نوع کلنی متفاوت رشدیافته، بر روی یک محیط عمومی مغذی همچون بلادآگار یا برین هارت آگار کشت خطی داده و برای 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سلسیوس گرم‌خانه‌گذاری گردید. بعد از اتمام مرحله خالص‌سازی، برای رسیدن به جنس باکتری جداشده، مبادرت به انجام رنگ‌آمیزی گرم، کشت در محیط OF، تست‌های کاتالاز، اکسیداز و همچنین کشت در محیط مک کانکی آگار برای تفریق جنس آن‌دسته از باکتری‌ها که در رنگ‌آمیزی، گرم منفی بودند، گردید.

2- در مسیر دوم به‌دلیل اهمیت جنس سالمونلا در آلودگی‌های غذایی و خطر بالای آن برای سلامتی جوامع انسانی، به‌طور جداگانه به بررسی و جستجوی این باکتری گرم منفی پرداخته شد.

بدین‌صورت که با نمونه‌برداری از برین هارت براث با استفاده از آنس استریل مبادرت به کشت در
2 محیط مایع آبگوشت سلنیت و آبگوشت تتراتیونات گردید. پس از طی شدن زمان 18- 15 ساعته انکوباسیون در 37 درجه سلسیوس از آنها در محیط X.L.D آگار، کشت خطی به‌عمل آمد (محیط انتخابی گرم منفی‌ها و افتراقی برای سالمونلا) و با گذشت زمان 24 ساعته انکوباسیون، محیط‌های کشت‌شده XLD آگار مورد بازرسی قرار گرفت. در صورت مشاهده کلنی‌های هم‌رنگ محیط کشت، شفاف با مرکز سیاه (SH2) با مشکوک شدن به خانواده سالمونلا به بررسی توانایی تجزیه اوره و لیزین و تولید رسوب SH2 در آنها و همچنین کشت در محیط‌های افتراقی سالمونلاشامل: مالنات، سیمون سیترات، SIM، تریپل شوگرآیرون آگار و  MR-VPو در نهایت با تأیید سالمونلا مبادرت به انجام تست‌های تأیید تشخیصی با آنتی‌سرم پلی‌والان گردید.

در رابطه با سرنوشت محیط‌های کشت بی‌هوازی تیوگلیکولات، بعد از انجام کشت مستقیم از زرده، درب لوله‌ها به‌دقت بسته شده و  درجه سلسیوس مورد انکوباسیون قرار گرفت. بعد از سپری شدن این مدت محیط‌ها مورد بازرسی قرار گرفتند. در صورت مشاهده رشد باکتری و ایجاد کدورت در این محیط، اقدام به کشت  خطی در یک محیط عمومی همچون برین هارت آگار یا بلادآگار و انکوباسیون در
37 درجه سلسیوس در جار بی‌هوازی حاوی گازپک A برای 48-24 ساعت گردید در ادامه در صورت مثبت بودن رشد باکتری در این محیط مبادرت به انجام رنگ‌آمیزی گرم و تست‌های تفریقی اکسیداز و کاتالاز و کشت در محیط OF به‌منظور تشخیص تفریقی کلستریدیوم‌ها با سایر باکتری‌ها من‌جمله استافیلوکوک که هوازی- بی‌هوازی اختیاری است گردید. (لازم به ذکر است که کلستریدیوم باسیل گرم مثبت، فرمنتاتیو و اکسیداز و کاتالاز منفی است که در پژوهش ما یافت نگردید).

 

یافته­ها

میزان آلودگی باکتریایی درپوسته

 

 

جدول 1: فراوانی آلودگی در پوسته

آلودگی در پوسته

فراوانی %

درکل تخم‌مرغ‌ها

 16/99  

در تخم‌مرغ‌های با پوسته کثیف

82/98

در تخم‌مرغ‌های با پوسته تمیز

100 

 

 

جدول 2: مقایسه درصد آلودگی کل پوسته در 2 گروه تخم‌مرغ با پوسته تمیز و آلوده

حالت

Z

پارامتر

n.s

96/1 > 64/0 (P-Value 0.05)

مقایسه میزان آلودگی در پوسته

 

n.s: غیرمعنی‌دار

S: P<0.05 

SS: P<0.01

میزان آلودگی در زرده

 

 

جدول3: فراوانی آلودگی در زرده

آلودگی در زرده

فراوانی %

درکل تخم‌مرغ‌ها

83/15

در تخم‌مرغ‌های با پوسته کثیف

47/16

در تخم‌مرغ‌های با پوسته تمیز

28/14

 

 

جدول 4: مقایسه درصد آلودگی کل زرده در دو گروه تخم‌مرغ با پوسته تمیز و آلوده

حالت

Z

پارامتر

n.s

96/1 > 3/0 (P-Value 0.05)

مقایسه میزان آلودگی

در زرده

 

n.s: غیرمعنی‌دار

S: P<0.05 

SS: P<0.01

 

 

جدول 5: فراوانی باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت سطح پوسته

نوع باکتری‌های سطح پوسته

فراوانی %

گرم منفی (gr-)

55/23

گرم مثبت (gr+)

45/76

 

جدول6: فراوانی باکتری‌های گرم منفی (gr -) پوسته

فراوانی در تخم‌مرغ‌های با پوسته تمیز

فراوانی در تخم‌مرغ‌های با پوسته آلوده

فراوانی

در کل تخم‌مرغ‌ها

جنس

خانواده

57/8

76/11

83/10

E.coli

 

Enterobacteriacae

 

-

52/3

5/2

Enterobacter

75/2

70/4

16/4

CitroBacter

75/2

05/7

83/5

Proteus

-

17/1

83/0

Salmonella

-

17/1

83/0

Bordetella

 

40

88/5

33/18

Pseudomonas

 

-

35/2

66/1

Actinobacillus

 

-

35/2

66/1

Francissella

 

-

17/1

83/0

Aeromonas

 

جدول 7: مقایسه درصد آلودگی باکتری‌های گرم منفی در پوسته
2 گروه تخم‌مرغ با پوسته تمیز و آلوده

حالت

Z

پارامتر

n.s

96/1 > 51/0

E.Coli

n.s

96/1 > 126/1

Enterobacter

n.s

96/1 > 46/0

Citrobacter

n.s

96/1 > 89/0

Proteus

n.s

96/1 > 64/0

Salmonella

n.s

96/1 > 64/0

Bordetella

SS

96/1 < 65/4

Pseudomonas

5/2 < 65/4

n.s

96/1 > 91/0

ActinoBacillus

n.s

96/1 > 91/0

Francissella

n.s

96/1 > 64/0

Aeromonas

 

n.s: غیرمعنی‌دار               S: P<0.05                      SS: P<0.01

 

جدول 8: فراوانی باکتری‌های گرم مثبت(gr +) پوسته

فراوانی در تخم‌مرغ‌های با پوسته تمیز 

فراوانی در تخم‌مرغ‌های با پوسته آلوده

فراوانی  در کل تخم‌مرغ‌ها

جنس

14/77

17/81

80

Bacillus

42/11

52/43

16/34

Staphylococcus

28/14

29/15

15

Streptococcus

57/8

41/9

16/9

Rhodococcus

-

17/1

83/0

LactoBacillus

75/2

52/3

33/3

Eryseopelotrix

-

58/10

5/7

Micrococcus

-

70/4

33/3

Corynebacter

-

17/1

83/0

مخمر

 

 

جدول9: مقایسه درصد آلودگی باکتری‌های گرم مثبت در پوسته 2 گروه تخم‌مرغ با پوسته تمیز و آلوده

حالت

Z

پارامتر

n.s

96/1 > 50/0

Bacillus

SS

96/1 < 37/3

Staphylococcus

5/2 < 37/3

n.s

96/1 > 14/0

Streptococcus

n.s

96/1 > 14/0

Rhodococcus

n.s

96/1 > 64/0

Lactobacillus

n.s

96/1 > 18/0

Eryseopelotrix

S

96/1 > 00/2

Micrococcus

5/2 > 00/2

n.s

96/1 > 64/0

Corynebacter

n.s

96/1 > 64/0

مخمر

 

n.s: غیرمعنی‌دار               S: P<0.05                      SS: P<0.01

جدول 10: فراوانی باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت آلوده‌کننده زرده

نوع باکتری‌های آلوده‌کننده زرده

فراوانی %

گرم منفی (gr-)

68/73

گرم مثبت (gr+)

31/26

 

 

جدول 11: فراوانی باکتری‌های گرم منفی(gr-) زرده

با پوسته تمیز 

با پوسته آلوده

کل تخم‌مرغ‌ها

جنس

85/2

17/1

66/1

Acinetobacter

-

17/1

83/0

Enterobacter

20

52/3

3/8

Pseudomonas

-

17/1

83/0

ActinoBacillus

 

 

جدول 12: مقایسه درصد آلودگی باکتری‌های گرم منفی در زرده دو گروه تخم‌مرغ با پوسته تمیز و آلوده

حالت

Z

پارامتر

n.s

96/1 > 65/0

Acinetobacter

n.s

96/1 > 64/0

Enterobacter

SS

96/1 > 97/2

Pseudomonas

5/2 < 97/2

n.s

96/1 > 64/0

ActinoBacillus

 

n.s: غیرمعنی‌دار

S: P<0.05 

SS: P<0.01

 

 

جدول 13: فراوانی باکتری‌های گرم مثبت (gr +) زرده

با پوسته تمیز 

با پوسته آلوده

کل تخم‌مرغ‌ها

جنس

-

88/5

16/4

Bacillus

 

 

 

 

جدول 14: مقایسه درصد آلودگی باکتری‌های گرم مثبت در زرده 2 گروه تخم‌مرغ با پوسته تمیز و آلوده

حالت

Z

پارامتر

n.s

96/1 > 47/1

Bacillus

 

n.s: غیرمعنی‌دار

S: P<0.05 

SS: P<0.01

بحث و نتیجه­گیری

با بررسی نتایج به‌نظر می‌رسد فراوانی بالای باسیلوس، استافیلوکوکوس و سودوموناس می‌تواند ناشی از آلودگی‌های محیطی باشد چرا که این باکتری‌ها علاوه‌براین‌که جزو مهم‌ترین و فراوان‌ترین باکتری‌های موجود در محیط و غشاهای طبیعی می‌باشند، نسبت به شرایط بد محیطی نیز مقاومت بالایی دارند (به‌ویژه استافیلوکوکوس و سودوموناس)، همچنین از دلایل بالا بودن میزان این باکتری‌ها می‌توان به رشد ساده و سریع آنها در مقایسه با سایر باکتری‌ها اشاره کرد که باعث می‌شود نمونه‌های بیشتری در قیاس با باکتری‌های سخت رشد جدا شوند. Kaleidari و همکاران با انجام پژوهشی در سال 1385 این‌طور بیان داشتند که باسیلوس‌ها به‌طور طبیعی در مدفوع وجود دارند و آلودگی پوسته تخم‌مرغ از طریق مدفوع در بالا بردن میزان جداسازی این دسته ازباکتری‌ها حائز اهمیت است (Kaleidari, 2005). در درجه بعدی اهمیت، بالا بودن میزان آلودگی به انتِروباکتریاسه در پژوهش حاضر می‌تواند ناشی از آلوده شدن تخم‌مرغ به ترشحات دستگاه گوارش در کلوآک مرغ در حین تخمگذاری باشد. میزان بالای این دسته از باکتری‌ها در مدفوع، بالا بودن درصد جداسازی آنها را در پژوهش حاضر توجیح می‌کند. به‌ویژه بالا بودن نسبی این باکتری‌ها در تخم‌مرغ‌های با پوسته آلوده در این تحقیق موید مطلب فوق است.

با بررسی نتایج پژوهش‌های مشابه و مقایسه آن با نتایج پژوهش حاضر هم‌خوانی‌های فراوانی در این زمینه مشاهده می‌گردد.

در تحقیق Seviour و همکاران در سال 1973، باسیلوس‌ها به‌ویژه باسیلوس سرئوس و باسیلوس سوبتیلیس از پوسته جداسازی گردید که فراوانی باسیلوس سرئوس جداگردیده از پوسته %41/16
بود (Seviour, 1972).

کلیدری و همکاران در سال 1385 با کار بر روی 120 عدد تخم‌مرغ قابل‌جوجه‌کشی، میزان آلودگی پوسته را %66/96 و میزان آلودگی را در زرده %3/3 گزارش نمودند. همچنین بیشترین میزان باکتری جداشده از جنس باسیلوس با فراوانی %6/86 و در درجه بعدی اهمیت استافیلوکوک با فراوانی %9/19 می‌باشد. همچنین بر طبق نتایج به‌دست‌آمده از تحقیق Bruce و همکاران در سال 1978 عمده باکتری‌های آلوده‌کننده پوسته تخم‌مرغ‌های هچ نشده شامل: استرپتوکوک، استافیلوکوک، سودوموناس، میکروکوک، باسیلوس و خانواده انتروباکتریاسه بودند که با پژوهش ما هم‌خوانی دارد (Kaleidari, 2005).

De Reu و همکاران در سال 2006 با انجام تحقیقی روی پوسته تخم‌مرغ‌ها، بیشترین باکتری جدا شده را سودوموناس با فراوانی %60 اعلام نمودند، همچنین Musgrove و همکاران در سال 2008 با نمونه‌برداری از پوسته تخم‌مرغ‌ها، بیشترین باکتری غیرخانواده انتروباکتریاسه را سودوموناس ذکر نمودند که با بیشترین باکتری گرم منفی جداشده از پوسته در پژوهش ما هم‌خوانی
دارد (De Reu 2006; Musgrove, 2007).

در ارتباط با میزان پایین آلودگی زرده در مقایسه با پوسته نکات ذیل قابل‌توجه می‌باشد. تخم‌مرغ دارای  سدهای فیزیکی و شیمیایی متعددی است که در جلوگیری از نفوذ باکتری‌ها نقش مهمی دارد که احتمال رسیدن آلودگی به زرده را به حداقل می‌رساند.از طرف دیگر برای نفوذ آلودگی از پوسته به محتویات تخم‌مرغ فاکتور زمان بسیار مؤثر هست.

در پژوهش ما، %83/15 آلودگی در زرده به اثبات رسید. از این تعداد. بیشترین سهم به سودوموناس با فراوانی %3/8 تعلق داشت. لازم به ذکر است که %68/73  آلودگی زرده  ناشی از باکتری‌های گرم منفی بود که حدود 3 برابر بیشتر از فراوانی باکتری‌های گرم مثبت جداگردیده از زرده است (%31/26) و این درحالی‌ است که میزان این فراوانی‌ها روی پوسته دقیقاً عکس این حالت است (گرم منفی %55/23 و گرم مثبت %45/76) این تفاوت را می‌توان تا حدود زیادی به‌خاطر قدرت ضدباکتریایی سفیده دانست. که به‌دلیل داشتن لیزوزیم باعث تخریب دیواره باکتری‌های گرم  مثبت شده و مانند سدی از میزان نفوذ و رشد این باکتری‌ها می‌کاهد. همچنین De Reu و همکاران در سال 2006 با انجام تحقیقی نشان دادند که اغلب باکتری‌های نفوذی به زرده، جزو دسته گرم منفی‌ها، متحرک
و غیرخوشه‌ای (تکی) بودند و بیشترین سهم را سودوموناس‌ها تشکیل می‌دادند که کاملاً با پژوهش ما تطابق دارد ( De Reu, 2006).

در سال 2003، Cook و همکاران با انجام مطالعه‌ای بر روی عفونت‌های منتقل‌شونده از طریق پوسته تخم‌مرغ، گزارش نمودند که در %16 موارد، باکتری‌های خانواده انتروباکتریاسهاز پوسته جدا شده‌اند که در این بین بیشترین موارد شامل اشریشیاکولای وپروتئوسودر درجه بعدی اهمیتسراتیا، سیتروباکتر، انتروباکتر و یرسینیا بودند. همچنین باکتری سودوموناس در %15  پوسته‌ها و %22 زرده‌ها گزارش شده است و باسیلوس‌ها با
%39  فراوانی بیشترین باکتری جداشده از پوسته بودند و در نهایت باکتری‌های جنس استرپتوکوک، استافیلوکوک و میکروکوک در %20 پوسته‌ها گزارش
شدند (Cook, 2003).

در ارتباط با عوامل مهم بیماری‌زای منتقل‌شونده توسط تخم‌مرغ به‌ویژه سالمونلا در پژوهش حاضر تنها یک مورد مثبت از پوسته به‌دست آمد که آن هم از سرووار انتریتیدیس بود و هیچ سالمونلایی از زرده جداسازی نگردید. جمشیدی با انجام تحقیقی در سال 1363 بر روی پانصد عدد تخم‌مرغ مصرفی، تنها
1 مورد سالمونلا و Poppe و همکاران در سال 1992 با نمونه‌برداری از چهارده هزار تخم‌مرغ اخذشده از چند گله تخم‌گذار در کانادا فقط 1 مورد سالمونلا انتریتیدیس از پوسته جدا کردند (Poppe, 1992).
 Jonesو همکاران در سال 2007 با نمونه‌برداری از تخم‌مرغ‌های مصرفی، میزان  %1/1 سالمونلااز پوسته، Shareef و همکاران با ارزیابی صد عدد تخم‌مرغ بومی و تخم اردک در عراق، % 6 سالمونلا تیفی‌موریم از پوسته و Ching-Lee و همکاران در سال 1991 با بررسی تخم‌مرغ‌های خوراکی در هاوائی %4/9 سالمونلا از پوسته جداسازی کردند.  
Ozyer و همکاران در سال 1992 با تحقیق
بر روی 400 عدد تخم‌مرغ صنعتی موفق به
جداسازی سالمونلااز پوسته یا محتویات نشدند

 (Ching, 1991; Jones, 2007; Ozyer, 1999; Shareef, 1997).

 

در رابطه با آلودگی محتویات به سالمونلا در پژوهش ما، مورد مثبتی یافت نگردید که با تحقیق Chapman
و همکاران که در سال 1998 بر روی 1000 عدد
تخم‌مرغ اخذشده از گله‌ای با آلودگی طبیعی به
سالمونلا تیفی‌موریوم انجام شد و  موفق به جداسازی سالمونلا از محتویات تخم‌مرغ نشدند هم‌خوانی
دارد (Chapman, 1988).

Hayemi و همکاران  در سال 1376 با نمونه‌گیری از
1200 عدد تخم‌مرغ در تهران 9 مورد سالمونلا با فراوانی کمتر از %1 از محتویات تخم‌مرغ‌ها جدا کردند. همچنین در پژوهشی که در سال 1382
توسط جعفری و همکاران بر روی 300 تخم‌مرغ بومی مصرفی در اهواز انجام گرفت، %66/1
آلودگی سالمونلایی از محتویات تشخیص داده
شد (Hayemi, 1997; Jaafari, 2006 ).

بر طبق نتایج به‌دست‌آمده از تحقیق Musgrove و همکاران در سال 2007، این محققین این‌گونه بیان داشتند که انتقال از پوسته نقش مهمی در آلودگی محتویات به سالمونلا انتریتیدیس ندارد ( Musgrove, 2007).

با مطالعه نتایج، مشخص می‌شود که آلوده بودن یا نبودن پوسته به مدفوع نمی‌تواند دلیل بر عدم وجود باکتری باشد. نکته‌ای که می‌بایست مورد توجه قرار گیرد این است که آلوده بودن پوسته به مدفوع می‌تواند منجر به افزایش تعداد باکتری بر روی پوسته شده و ریسک آلوده کردن محتویات را افزایش دهد. همان‌طورکه De Reu و همکاران در سال 2006 در تحقیق خود این‌گونه نتیجه‌گیری کردند که پوسته تخم‌مرغ‌های مورد نفوذ قرار گرفته (دارای ترک) در مقایسه با پوسته‌های مورد نفوذ قرار نگرفته و همچنین محتویات تخم‌مرغ‌های آلوده به مدفوع در مقایسه با محتویات تخم‌مرغ‌های غیرآلوده، به‌طور مشخصی میزان بالاتری از آلودگی باکتریایی را  نشان می‌دهند.Jones  و همکاران با انجام تحقیقی در سال 2004 نشان دادند که تخم‌مرغ‌های شسته‌شده تجاری به‌طور مشخصی دارای آلودگی کمتری از لحاظ جمعیت باکتریایی نسبت به تخم‌مرغ‌های نشسته هستند. نکته
دیگری که از نظر سلامت جامعه واجد اهمیت است این مسأله است که بالا بودن میزان
آلودگی پوسته در هنگام شکستن پوسته تخم‌مرغ به‌منظور استفاده از تخم‌مرغ به‌صورت خام، می‌تواند باعث آلودگی محتویات و بروز آلودگی گردد (De Reu, 2006; Jones, 2007).

در ارتباط با نتایج به‌دست‌آمده با استفاده از آزمون آماری Z موارد ذیل قابل‌ذکر است:

1- مقایسه درصد آلودگی کل پوسته در دو گروه مورد آزمایش (تخم‌مرغ‌های با پوسته آلوده و تمیز) در دو سطح اطمینان 95% و 99% با توجه به P-Value اختلاف معنی‌دار نیست. این نتایج نشان‌دهنده این مطلب می‌باشد که آلوده بودن و یا نبودن پوسته به مدفوع نمی‌تواند دلیلی بر بودن یا نبودن باکتری باشد.

در ارتباط با مقایسه جداگانه هر کدام از جنس‌های باکتریایی تقریباً در ارتباط با تمامی جنس‌ها میزان جداسازی باکتری از تخم‌مرغ‌های با پوسته آلوده بیشتر بود هرچند برخی از لحاظ آماری معنی‌دار نبودند به‌ویژه در مورد خانواده انتروباکتریاسه، جنس باسیلوس، استافیلوکوک، استرپتوکوک . اما نتایج از لحاظ آماری در مورد برخی از این جنس‌ها همچون استافیلوکوک و میکروکوک  معنی‌دار بودند.

تنها استثناء، جداسازی بیشتر جنس سودوموناس در گروه با پوسته تمییز می‌باشد. با توجه به نتایج خام، متوجه می‌شویم که اغلب موارد مربوط به نمونه‌های اخذشده از یکی از مراکز می‌باشد که می‌تواند ناشی از آلودگی بالای محیطی این مرکز باشد.

2- در ارتباط با آلودگی زرده در دو گروه مورد آزمایش، میزان جداسازی باکتری در گروه با پوسته آلوده بیشتر بود، به‌ویژه در مورد باکتری‌های گرم مثبت هیچ مورد مثبتی در گروه با پوسته تمیز جدا نشد درحالی‌که در 88/5%  موارد، گروه با پوسته آلوده، باکتری گرم مثبت جدا گردید.

در مورد باکتری‌های گرم منفی نیز فراوانی انتروباکتریاسه در گروه با پوسته آلوده بیشتر بود. جداسازیسودوموناس بیشتر در گروه با پوسته تمیز نیز ناشی از نحوه نمونه‌برداری می‌باشد که در بالا توضیح داده شد.

با توجه به نتایج فوق به‌نظر می‌رسد که آلوده نبودن پوسته به مدفوع نمی‌تواند در مصرف تخم‌مرغ به‌صورت خام یا نیم‌پز اطمینان‌بخش باشد. وجود آلودگی مدفوعی بر روی پوسته تخم‌مرغ باعث افزایش تعداد باکتری بر روی آن گشته و ریسک آلودگی محتویات تخم‌مرغ به‌ویژه در زمان شکستن تخم‌مرغ را در پی خواهد داشت. عدم استفاده از تخم‌مرغ‌های به‌شدت آلوده از لحاظ ظاهری و همچنین شستشوی با دقت تخم‌مرغ‌های با آلودگی ظاهری کمتر قبل از شکستن آن جهت دسترسی به محتویات به‌منظور کاهش ریسک انتقال عوامل باکتریایی به محتویات، اکیداً توصیه می‌شود.

 

سپاسگزاری

از آقای ابراهیم شرقی کارشناس محترم آزمایشگاه میکروب‌شناسی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز قدردانی می‌گردد.

 

 

 

 

منابع

 

Ÿ Chapman, P.A., Rhodes, P. and Rylands, W.)1988(. Salmonella typhimurium phage type 141 infections in Sheffield during 1984 and 1985: association with hens' eggs. Epidemiology and infection, 101: 75-82.

Ÿ Ching–Lee, M.R. and Katz, A.R. (1991). Salmonella egg survey in Hawaii. Evidence for routine bacterial surveillance. American Journal of Public Health, 81(60): 764-766.

Ÿ Cook Mark, I., Beisinger Steven, R., Toranzos Gary, A., Rodriguez Roberto, A. and Arendt, W.J. (2003). Trans-shell infection by pathogenic micro-organism reduces the shelf life of non-incubated bird's eggs: a constraint on the onset of incubation. Proceedings of the Royal Society, 270: 2233-2240.

Ÿ De Reu, K., Grijspeerdt, K., Herman, L., Heyndrickx, M., Uytendaele, M., Debevere, J., Putirulan, F.F. and Bolder, N.M. (2005). The effect of a comerical UV disinfection system on the bacterial load of shell eggs. Letters in applied Microbiology, (42): 144-148.

Ÿ De Reu, K., Grijspeerdt, K., Messens, W., Heyndrickx, M., Uyttendaele, M., Debevere, J. and Herman, L. (2006). Eggshell factors influencing eggshell penetration and whole egg contamination by different bacteria, including Salmonella enteritidis. British Poultry Science, 46(2): 142-149.

Ÿ Favier, G.I., Escudero, M.E. and De Guzman, A.M.S. (2008). Thermal inactivation of Yersinia Entrocolitica in liquid egg products. Journal of Food Safety, 28: 157-169.

Ÿ Jaafari, R., Fazlara, A. and Dalirannia, A. (2006). An investigation into Salmonella contamination of native hens eggs in Ahvaz, Iranian Veterinary journal, 2: 58-63. 

Ÿ Jones, D.R. and Musgrove, M.T. (2007). Pathogen prevalence and microbial levels associated with restricted shell eggs. Journal of Food Protection, 70(9): 2004-2007.

Ÿ Hayemi, P., Hadian, Z. and Velaii, N. (1997). The distribution of Salmonella infection in egg yolks consumed in Tehran Province, Iran Veterinary Association Journal, 10: 27-30.

Ÿ Kalidari, G.A., Pourakhondi Darzi, H. and Hashemitabar, G.R. (2005). Isolation and identification of facultative aerobic- anaerobic gram-positive bacteria in hatching eggs. Journal of Veterinary Research, 61:115-118.

Ÿ March, B.E. (1969). Bacterial infection of washed and unwashed eggs with reference to Salmonellae. Applied Microbiology, 17: 98-101.

Ÿ Musgrove, M.T., Northcutt, J.K., Jones, N.A. and Harrison, M.A. (2007). Enterobacteriacae and Related Organisms Isolated from Shell Eggs Collected During Commercial Processing. Poultry Science, 87: 1211-1218.

Ÿ Ozyer, M. and Inal, U. (1999). Studies on the isolation of Salmonella from eggs. Etlik-Veterinary Microbiology-Dergisi, 7(2): 109-115.

Ÿ Poppe, C., Johnson, R.P., Forsbery, C.M. and Irwin, R.I. (1992). Salmonella enteritidis and other Salmonellaein laying hens and eggs from flocks with Salmonella in their environment.  Canadian Journal of Veterinary Research, 56(3): 226-232.

Ÿ Quinn,P.J., Markey, B.K., Carter, M.E., Donnelly, W.J. and Leonard, F.C. (2002). Veterinary Microbiology Disease by Blackwell Science, 2: 176-180.

Ÿ Seviour Elizabeth, M., Sykes Felicity, R. and Board, R.G. (1972). A microbiological survey of the incubated eggs of chickens and waterfowl. British Poultry Science, 13: 549-556.

Ÿ Shareef, A.M., Al-Sanjary, R.A. and Hassan, A.A. (1997). Recovery of two types of Salmonella from eggs of range rearing hens and ducks. Iraqi Journal of Veterinary Science, 10(2): 25-28.

Ÿ Tabatabayi, A.H. and Firouzi, R. (2001). Diseases of animals due to Bacteria. TehranUniversity Press, pp. 255-259 [In Farsi].

 

 

Ÿ Chapman, P.A., Rhodes, P. and Rylands, W.)1988(. Salmonella typhimurium phage type 141 infections in Sheffield during 1984 and 1985: association with hens' eggs. Epidemiology and infection, 101: 75-82.

Ÿ Ching–Lee, M.R. and Katz, A.R. (1991). Salmonella egg survey in Hawaii. Evidence for routine bacterial surveillance. American Journal of Public Health, 81(60): 764-766.

Ÿ Cook Mark, I., Beisinger Steven, R., Toranzos Gary, A., Rodriguez Roberto, A. and Arendt, W.J. (2003). Trans-shell infection by pathogenic micro-organism reduces the shelf life of non-incubated bird's eggs: a constraint on the onset of incubation. Proceedings of the Royal Society, 270: 2233-2240.

Ÿ De Reu, K., Grijspeerdt, K., Herman, L., Heyndrickx, M., Uytendaele, M., Debevere, J., Putirulan, F.F. and Bolder, N.M. (2005). The effect of a comerical UV disinfection system on the bacterial load of shell eggs. Letters in applied Microbiology, (42): 144-148.

Ÿ De Reu, K., Grijspeerdt, K., Messens, W., Heyndrickx, M., Uyttendaele, M., Debevere, J. and Herman, L. (2006). Eggshell factors influencing eggshell penetration and whole egg contamination by different bacteria, including Salmonella enteritidis. British Poultry Science, 46(2): 142-149.

Ÿ Favier, G.I., Escudero, M.E. and De Guzman, A.M.S. (2008). Thermal inactivation of Yersinia Entrocolitica in liquid egg products. Journal of Food Safety, 28: 157-169.

Ÿ Jaafari, R., Fazlara, A. and Dalirannia, A. (2006). An investigation into Salmonella contamination of native hens eggs in Ahvaz, Iranian Veterinary journal, 2: 58-63. 

Ÿ Jones, D.R. and Musgrove, M.T. (2007). Pathogen prevalence and microbial levels associated with restricted shell eggs. Journal of Food Protection, 70(9): 2004-2007.

Ÿ Hayemi, P., Hadian, Z. and Velaii, N. (1997). The distribution of Salmonella infection in egg yolks consumed in Tehran Province, Iran Veterinary Association Journal, 10: 27-30.

Ÿ Kalidari, G.A., Pourakhondi Darzi, H. and Hashemitabar, G.R. (2005). Isolation and identification of facultative aerobic- anaerobic gram-positive bacteria in hatching eggs. Journal of Veterinary Research, 61:115-118.

Ÿ March, B.E. (1969). Bacterial infection of washed and unwashed eggs with reference to Salmonellae. Applied Microbiology, 17: 98-101.

Ÿ Musgrove, M.T., Northcutt, J.K., Jones, N.A. and Harrison, M.A. (2007). Enterobacteriacae and Related Organisms Isolated from Shell Eggs Collected During Commercial Processing. Poultry Science, 87: 1211-1218.

Ÿ Ozyer, M. and Inal, U. (1999). Studies on the isolation of Salmonella from eggs. Etlik-Veterinary Microbiology-Dergisi, 7(2): 109-115.

Ÿ Poppe, C., Johnson, R.P., Forsbery, C.M. and Irwin, R.I. (1992). Salmonella enteritidis and other Salmonellaein laying hens and eggs from flocks with Salmonella in their environment.  Canadian Journal of Veterinary Research, 56(3): 226-232.

Ÿ Quinn,P.J., Markey, B.K., Carter, M.E., Donnelly, W.J. and Leonard, F.C. (2002). Veterinary Microbiology Disease by Blackwell Science, 2: 176-180.

Ÿ Seviour Elizabeth, M., Sykes Felicity, R. and Board, R.G. (1972). A microbiological survey of the incubated eggs of chickens and waterfowl. British Poultry Science, 13: 549-556.

Ÿ Shareef, A.M., Al-Sanjary, R.A. and Hassan, A.A. (1997). Recovery of two types of Salmonella from eggs of range rearing hens and ducks. Iraqi Journal of Veterinary Science, 10(2): 25-28.

Ÿ Tabatabayi, A.H. and Firouzi, R. (2001). Diseases of animals due to Bacteria. TehranUniversity Press, pp. 255-259 [In Farsi].