تعیین انتروتوکسین‌های کلاسیک استافیلوکوکوس‌اورئوس جدا‌شده از ناگت مرغ و غذاهای آماده مصرف در استان اصفهان به روش ELISA

مقدمه

   امروزه غذاهای آماده مصرف حتی در کشورهای در حال توسعه به دلیل تنوع غذایی در کنار سهولت مصرف و عدم نیاز به پخت طرفداران زیادی پیدا کرده و مصرف آن رو به افزایش است. با این وجود، گزارش­های فراوانی از آلودگی این غذاها به استافیلوکوکوس اورئوس مولد انتروتوکسین از نقاط مختلف دنیا حتی کشورهای توسعه یافته همچون آمریکا و ژاپن و به­ویژه کشورهای جنوب‌شرقی آسیا (تایوان، تایلند، کره جنوبی) وجود دارد (Chomvarin et al., 2006; Reji and Antrekker, 2004). جنس استافیلوکوکوس متعلق به خانواده میکروکوکاسه بوده که مهم­ترین گونه این جنس استافیلوکوکوساورئوس می­باشد. استافیلوکوکوساورئوس عامل اصلی مسمومیت غذایی استافیلوکوکی و عفونت­های خارج روده­ای  مانند زخم، دمل، ذات الریه، مننژیت و غیره است (Redmond and Griffith, 2003). تاکنون 18 انتروتوکسین تولیدی از استافیلوکوکوس اورئوس گزارش شده که انتروتوکسین‌های کلاسیک A، B، C و D مهم­ترین عامل شیوع مسمومیت به شمار می‌روند. از نظر مقاومت به شرایط فیزیکی و شیمیایی تقریباً تمام سروتیپ­های انتروتوکسین به جز انتروتوکسین B و C در مقابل حرارت و عوامل آنزیمی از جمله تریپسین موجود در دستگاه گوارش مقاوم‌اند (Paciorek et al., 2007). انتروتوکسین هایA  وB  به عنوان عوامل اصلی گاستروانتریت شناخته شده­اند.  SEAدر برخی از مناطق عامل بیش از 50 درصد مسمومیت‌های غذایی بوده، همچنین در بریتانیا و ایالات متحده آمریکا SEA و SEB عامل بیش از 69 درصد کل مسمومیت­های غذایی به شمار می­رود (Kluytmans and Wertheim, 2005). در ایالات متحده بین سال­های ۱۹۸۳ تا ۱۹۸۷ استافیلوکوکوس اورئوس 8/7% (47 مورد) از 600 مورد شیوع مسمومیت‌های غذایی باکتریایی را تشکیل می­داد. در انگلستان و ولز در طی همان دوره زمانی مسمومیت غذایی استافیلوکوکی 9/1% (54 مورد) از کل 2815 مورد شیوع مسمومیت را در بر می­گرفت (Fueyo et al., 2005; Martin et al., 2004). گزارشات زیادی از ارزیابی میکروبی انواع غذاهای آماده مصرف و آلودگی آن­ها به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و انتروتوکسین تولید شده از آن در نقاط مختلف جهان وجود دارد که از آن جمله می­توان به مطالعات نورمانو (2005-2007)، اوه (2007) و لین (2009) اشاره کرد. استافیلوکوکوس اورئوس اغلب در شیر خام ورم پستانی و فرآورده­های لبنی مختلف مانند پنیر و همچنین در فرآورده­های گوشتی یافت می­شود. لذا این فرآورده­ها به عنوان منابع مهم توکسین­های استافیلوکوکوس اورئوس شناخته شده­اند. از طرف دیگر به دلیل تحمل بالای استافیلوکوکوس اورئوس به aw پایین و نمک و قدرت رشد در دامنه وسیعی از دما و pH از مهم­ترین باکتری‌های بیماری‌زای مولد مسمومیت به شمار می­رود (Normanno and Lasalandra, 2007). بنابراین به دلیل اهمیت این توکسین­ها در سلامت عمومی مطالعات فراوانی در خصوص تعیین شیوع سوش­های توکسین­زا و بررسی حضور توکسین­های استافیلوکوکوس اورئوس در مواد غذایی در تمام نقاط مختلف دنیا انجام شده است. مطالعه حاضر با هدف بررسی فراوانی انتروتوکسین­های استافیلوکوکیA, B, C, D  در استافیلوکوکوس اورئوس جدا شده از ناگت مرغ و غذاهای آماده مصرف در استان اصفهان طراحی و انجام شده است.

مواد روش­ها

جمع­آوری نمونه­ها

   در تابستان 1391 در مجموع 420 نمونه انواع ناگت مرغ تولیدی در 9 شرکت مختلف به طور تصادفی از مراکز فروش در استان اصفهان جمع­آوری و در اسرع وقت در کنار یخ به آزمایشگاه کنترل کیفی مواد غذایی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد انتقال داده شد و حداکثر 24 ساعت پس از نمونه­گیری از نظر حضور استافیلوکوکوس اورئوس و انتروتوکسین­های کلاسیک این باکتری مورد آزمایش قرار گرفتند.

جداسازی استافیلوکوکوس اورئوس

   ابتدا 10 گرم از هر نمونه به 90 گرم از محلول استریل بافر فسفات نمکی اضافه شد و سپس به مدت چند دقیقه گردید تا به صورت همگن درآید. جهت شمارش کلنی‌های استافیلوکوکوس اورئوس از محیط برد پارکر آگار (Difco, USA) مطابق با دستورالعمل لین و همکاران (2009) استفاده شد. رقت­هایی از محلول سوسپانسیون حاوی نمونه­ها را بر روی سطح پلیت برد پارکر آگار کشت سطحی داده و پس از 48-24 ساعت گرم‌خانه‌گذاری در دمای 35 درجه سلسیوس، در نهایت کلنی­ها از نظر ریخت­شناسی مورد بررسی قرار گرفتند و جهت تأیید شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس تست­های گرم، کاتالاز، کوآگولاز، تخمیر مانیتول و آزمون وگس پروسکاور (Vp) بر روی پرگنه­های مشکوک انجام گرفت (Kiedrowski et al., 2011).

شناسایی انتروتوکسین­های کلاسیک استافیلوکوکوس اورئوس

   به منظور تشخیص و شناسایی انتروتوکسین­های کلاسیک استافیلوکوکوس اورئوس، جدایه‌ها به مدت یک شب در 10 میلی­لیتر محیط آبگوشت مغذی (Merk Germany) در شرایط هوازی در دمای 37 درجه سلسیوس کشت داده شد. به منظور شناسایی انتروتوکسین­های SEA, SEB, SEC, SED, SEE  از روش الایزا استفاده گردید. مطابق دستورالعمل ارائه شده توسط شرکت سازنده کیت، نمونه­ها به مدت 10 دقیقه و حداکثر در دمای 10 درجه سلسیوس و با دور 3500 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. سپس لایه چربی سطح نمونه­ها برداشته شد. فاز آبی به نسبت 1 به 20 با آب مقطر سترون رقیق و با کمک فیلترهای سرنگی فیلتر شدند.

   کیت الایزای مورد استفاده در این مطالعه از شرکت R-Biopharm آلمانRIDASCREEN® SET (A, B, C, D, E Art.No:R4101,R-Biopharm AG,Germany) تهیه گردید. مقدار 100 میکرولیتر از محلول استاندارد و نمونه‌های آماده‌سازی شده به کمک سمپلر 10 میکرولیتری به حفره­های میکروپلیت اضافه و سپس به مدت 1 ساعت به دور از نور و در درجه حرارت 25-20 درجه سلسیوس نگه‌داری شد. سپس مایع موجود در میکروپلیت خارج شده و با ضربه زدن ملایم به میکروپلیت و قراردادن آن به شکل وارونه بر روی کاغذهای جاذب­الرطوبه مایع موجود در حفره­ها به طور کامل تخلیه شد، سپس همه حفره­ها با 250 میکرولیتر بافر مخصوص شستشو، شسته شد (عمل شستشو دوبار تکرار گردید) و هر بار بعد از تخلیه مایع شستشو میکروپلیت به طور وارونه بر روی چند لایه دستمال کاغذی قرار می­گرفت تا کاملا باقی‌مانده آب شستشو خارج شود به این ترتیب موادی که بعد از این مدت در واکنش شرکت نکرده‌اند خارج شدند. سپس مقدار 100 میکرولیتر محلول کونژوگه شده با آنزیم به حفره­ها اضافه شد و میکروپلیت به مدت یک ساعت دیگر در گرم­خانه 25-20 درجه سلسیوس قرار گرفت. بعد از این زمان، مایع موجود در حفره­ها به طور کامل تخلیه شد. سپس همه حفره­ها با 250 میکرولیتر بافر مخصوص شستشو، شسته شد. عمل شستشو دوبار تکرار گردید و هر بار بعد از تخلیه مایع شستشو میکروپلیت به طور وارونه بر روی چند لایه دستمال کاغذی قرار می‌گرفت تا کاملاً باقی‌مانده آن خارج شود. سپس 50 میکرولیتر سوبسترا و 50 میکرولیتر کروموژن به هر حفره اضافه شد و میکروپلیت به مدت 30 دقیقه در حرارت 25-20 درجه سلسیوس در تاریکی گرم­خانه­گذاری شد. در نهایت برای توقف واکنش، محلول قطع واکنش به مقدار 100 میکرولیتر به حفره­ها اضافه شد و میزان جذب هر نمونه با قرائت­کننده الایزا (Stat Fax 2100, England) در طول موج 450 نانومتر قرائت و اطلاعات مربوط به میزان جذب (OD) هر حفره به تفکیک ثبت شد. به منظور کنترل کیفیت آزمون بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده کیت میزان جذب ((OD کنترل مثبت باید برابر یا بیشتر از 5/0 واحد و میانگین میزان جذب (OD) برای کنترل منفی باید مساوی یا کمتر از 3/0 باشد.

   بعد از انتقال یافته­های بدست آمده به نرم افزار Excel، این اطلاعات با استفاده از نرم افزارSPSS/18 ، آزمون­های ضریب همبستگی و مربع کای در سطح (05/0>p) مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت.

یافته­ها

   جدول (1) وضعیت آلودگی نمونه­های ناگت مرغ را به استافیلوکوکوس اورئوس نشان می­دهد. از مجموع 420 نمونه ناگت مرغ 24 نمونه (7/5 درصد) از نظر آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس مثبت بودند. بیشترین آلودگی در نمونه­های شرکت C به میزان 10 درصد و کم‌ترین آلودگی در نمونه­های شرکت F به میزان 2/2 درصد مشاهده شد. در حالی که هیچ یک از 45 نمونه شرکت H و 40 نمونه شرکت I مورد مطالعه از نظر آلودگی به این پاتوژن مثبت نبودند (نمودار 1). با توجه به مقادیر به دست آمده اختلاف آماری معنی­داری بین میزان شیوع آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس در بین نمونه‌های مختلف ناگت مرغ وجود ندارد  (05/0p< ).

جدول 1- میزان و درصد فراوانی استافیلوکوکوس اورئوس­های مولد انتروتوکسین­های کلاسیک در نمونه­های ناگت مرغ در استان اصفهان

نمودار 1- آلودگی برندهای مختلف ناگت مرغ به استافیلوکوکوس اورئوس

از بین 24 سوش استافیلوکوکوس اورئوس جدا­ شده از نمونه­های ناگت مرغ 20 سوش (3/83 درصد) قادر به تولید انتروتوکسین­های کلاسیک (A-E) بودند (جدول 1). شایع­ترین انتروتوکسین کلاسیک تولید شده از بین سوش‌های مورد مطالعه انتروتوکسین A (40 درصد) و پس از آن انتروتوکسین­های C (15 درصد) و D (10 درصد) بوده است. همچنین سه سوش (15 درصد) قادر به تولید هر دو انتروتوکسین  Aو Dو سه سوش (15 درصد) قادر به تولید انتروتوکسین A وC بودند. قابلیت تولید انتروتوکسین E در هیچ­کدام از سوش­های استافیلوکوکوس اورئوس جدا­شده از نمونه­ها مشاهده نشد (نمودار 2).

نمودار 2- درصد شیوع انتروتوکسین­های تولیدی در ناگت مرغ (Brand A-I)

بحث و نتیجه­گیری

   باکتری استافیلوکوکوس اورئوس یکی از عوامل فرصت طلب بیماری­زا می­باشد که در شرایط مساعد قادر است در انسان و حیوانات ایجاد عفونت کند. این باکتری علاوه بر آن می­تواند موجب مسمومیت غذایی در افراد نیز شود. مسمومیت استافیلوکوکی مسمومیتی با منشا غذایی است که در اثر انتروتوکسین تولید شده توسط استافیلوکوکوس اورئوس ایجاد می‌گردد و اغلب مربوط به غذاهای آماده مصرفی است که پس از فرآیند آلوده شده­اند از جمله انواع سالادها و ساندویچ­ها که این مسئله خطر بالقوه­ای را برای سلامت جامعه به همراه دارد (Normanno and Lasalandra, 2007). به همین دلیل پژوهش­های فراوانی در خصوص تعیین شیوع سوش­های توکسین­زا و بررسی حضور توکسین‌های استافیلوکوکوس اورئوس در مواد غذایی در اغلب کشورها انجام شده است که نتایج به دست آمده نشان‌دهنده آلودگی 100-0 درصدی موادغذایی به استافیلوکوکوس اورئوس می­باشد. در مطالعه حاضر میزان شیوع استافیلوکوکوس اورئوس در نمونه­های ناگت مرغ 7/5 درصد تعیین شد. نتایج مطالعه حاضر با نتایج بسیاری از پژوهشگران دیگر هم‌خوانی دارد (Lin et al., 2009; Soriano et al., 2002). آیسیچک و همکاران میزان آلودگی غذاهای آماده مصرف به استافیلوکوکوس اورئوس را 4/9 درصد و اوه و همکاران این میزان را 6/8 درصد گزارش کردند که این نتایج با یافته‌های حاصل از مطالعه حاضر تقریباً مشابه است (Aycicek et al., 2005; Oh et al., 2007). نتایج بررسی حاضر درصد پائینی از آلودگی استافیلوکوکوس اورئوس در ناگت مرغ را نشان داده (7/5 درصد) که این نتایج با برخی از نتایج پیشین اختلاف معنی­داری (05/0P ≤) دارد (Known et al., 2006; McMahon, 2003). طی مطالعه­ای که بر روی سه گروه از مواد غذایی عرضه شده به بازار انجام گرفت میزان آلودگی غذاهای گوشتی آماده مصرف بیش­تر از دو محصول دیگر و در حدود 36 درصد گزارش شد (Moon et al., 2007). تاکنون در ایران نیز مطالعاتی در این راستا صورت گرفته است (Eshraghi and Salehipur, 2009; Tavakoli and Riazipour, 2008). در پژوهشی که توسط اشراقی و همکاران در شهرستان تهران بر روی 458 نمونه از فرآورده­های گوشتی خام و پخته انجام شد میزان آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس 5/3 درصد گزارش گردید (Eshraghi and Salehipur, 2009). توکلی و ریاضی­پور نمونه­های غذایی 6 مرکز بهداشتی درمانی در تهران را از نظر میکروبیولوژیک مورد بررسی قرار دادند و آلودگی 6/55 درصد به استافیلوکوکوس اورئوس مورد تایید قرار گرفت که بیش از نتایج بررسی ما بود (Tavakoli and Riazipour, 2008). همچنین طی مطالعه‌ای در ایران بر روی گوشت طیور نشان داده شد که 65 درصد نمونه­های گوشت طیور از نظر حضور استافیلوکوکوس اورئوس مثبت بودند (Javadi and Safarmashaei, 2011). در صورتی که نتایج حاصل از پژوهش فیضی و همکاران این مقدار را 75/81 درصد گزارش کردند (Feizi et al., 2012).

   در این مطالعه 20 سویه از 24 سویه استافیلوکوکوس اورئوس جدا­شده از نمونه­های ناگت مرغ (3/83 درصد) قدرت تولید انتروتوکسین­های کلاسیک را داشتند که شایع­ترین انتروتوکسین ردیابی شده در سوش­های استافیلوکوکوس اورئوس انتروتوکسین A (40 درصد)، پس از آن انتروتوکسین‌های C (15 درصد) و D (10 درصد) بود. همچنین سه سوش قادر به تولید هر دو انتروتوکسین A و D و سه سوش قادر به تولید انتروتوکسین A و C بودند و قابلیت تولید انتروتوکسین E در هیچ­کدام از سوش­های استافیلوکوکوس اورئوس جدا شده از نمونه­ها مشاهده نشد. نتایج حاصل از این مطالعه حاکی از آن است که استافیلوکوکوس اورئوس موجود در ناگت مرغ از نظر تولید انتروتوکسین SEA-SED فعال بوده که این نتایج با نتایج پیشین مطابقت دارد (Lim et al., 2004; Omoe and Ishikawa, 2002). آیدین و همکاران قدرت تولید انتروتوکسین­های کلاسیک استافیلوکوکوس اورئوس جداشده از مواد غذایی را 1/72 درصد بیان کردند که به­ترتیب انتروتوکسین  A، B وC  شایع­ترین انتروتوکسین­های ردیابی شده گزارش شدند و این میزان شیوع انتروتوکسین با داده­های حاضر هم‌خوانی دارد (Aydin and Sudagidan, 2011). در صورتی که در کره احتمال آلودگی به انتروتوکسین استافیلوکوکوس اورئوس در گوشت خام 8/7 درصد عنوان شد که اختلاف معنی­داری (05/0P≤) را با مطالعه حاضر نشان می‌دهد و علت آن را می‌توان به عدم رقابت استافیلوکوکوس اورئوس با فلور میکروبی گوشت خام دانست (Moon et al., 2007). گزارش بستان حاکی از آن است که به‌ترتیب 4/45 درصد، 9/10 درصد و 21 درصد از سوش­های استافیلوکوکوس اورئوس قادر به تولید انتروتوکسین­های A ،B  وC  بوده­اند که همانند مطالعه حاضر بالاترین میزان استافیلوکوکوس اورئوس مولد انتروتوکسین مربوط به سوش­های مولد انتروتوکسین A بوده است (Bostan and Cetin, 2006). طی پژوهشی به منظور بررسی عوامل مسمومیت غذایی در تایوان نشان داده شد که از بین انتروتوکسین­های عامل مسمومیت انواع A، B وC به‌ترتیب با پراکندگی 2/29 درصد، 7/19 درصد و 7/6 درصد نقش مؤثر داشتند (Chiang et al., 2008). در مطالعه انجام شده توسط نورمانو و همکاران بر روی 5369 نمونه غذای آماده مصرف در ایتالیا 2/45 درصد از سویه­های استافیلوکوکوس اورئوس جدا شده، حاوی ژن‌های تولید کننده انتروتوکسین بودند که در این میان سویه­های جدا شده تولیدی شاملSEA  (3/30 درصد)، SEB (6/7 درصد)، SEC (5/51 درصد)، SED (1/6 درصد)، SEA+SEB (5/1 درصد) و SEA+SED (3درصد) گزارش گردید (Normanno et al., 2005). در مطالعه دیگری بیش‌ترین انتروتوکسین جدا شده از سویه‌های استافیلوکوکی در کل نمونه­های گوشت و شیر SED با مقدار 6/33 درصد بود. شیوع SEA، SEC و SEB موجود در این نمونه­ها به­ترتیب 4/18 ،2/15 و 4/6 درصد گزارش شد در صورتی که در نمونه­های ناگت مرغ بیش­ترین انتروتوکسین جدا شده استافیلوکوکی SEA با مقدار 40 درصد و پس از آن به­ترتیب SEC (15 درصد) و SED (10 درصد) گزارش گردید (Normanno and Lasalandra, 2007). مطالعات نشان داده شایع­ترین انتروتوکسین استافیلوکوکوس اورئوس عامل مسمومیت‌های غذایی استافیلوکوکی انتروتوکسین A و به دنبال آن انتروتوکسین D می­باشد (Normanno et al., 2005). اگرچه انتروتوکسین C نیز به عنوان یکی از مهم‌ترین انتروتوکسین­های عامل مسمومیت غذایی معرفی شده است (Normanno and Lasalandra, 2007). طی مطالعه­ای SEB را به عنوان شایع‌ترین انتروتوکسین در غذاهای آماده مصرف و نوشابه­ها در کشورهای جنوب شرقی آسیا مانند مالزی و سنگاپور گزارش کردند که این داده با داده­های حاصل از مطالعه حاضر (SEA) هم‌خوانی ندارد (Ng and Tay, 1993). در ایران نیز با بررسی 913 نمونه غذایی، شایع­ترین انتروتوکسین تولیدی در فرآورده‌های لبنی، انتروتوکسین D (20%) و C (16%) و در فرآورده‌های گوشتی، انتروتوکسین D (6%) و E (3%) عنوان شد (Soltan Dallal et al., 2010).

   بازرسی نادرست گوشت طیور، نگه‌داری گوشت در شرایط نامناسب محیطی، عدم رعایت شرایط بهداشتی در کشتارگاه‌ها و در حین فرآیند تولید می­تواند از دلایل اصلی شیوع استافیلوکوکوس اورئوس در گوشت و فرآورده‌های آن از جمله نمونه­های ناگت طیور باشد. همچنین آلودگی بالای ماده اولیه یا حرارت‌دهی ناقص به بقای این پاتوژن در فرآورده کمک می‌کند. از طرفی احتمال آلودگی نمونه‌ها پس فرآیند تولید در حین بسته‌بندی و آسیب‌دیدگی بسته نیز وجود دارد. لذا با آموزش افراد در زمینه کنترل مسائل بهداشتی و اجرای سیستم­های GAPs، GMPs و HACCP در تمام مراحل تولید، انتقال، نگه‌داری و فروش می­توان شیوع مسمومیت استافیلوکوکی را به حداقل رساند.

سپاسگزاری

   نویسندگان از کارکنان مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و مرکز کنترل کیفی بهداشت مواد غذایی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، کمال تشکر و قدردانی را دارد.