شناسایی، جداسازی، تخلیص و بررسی طیف اثر باکتریوسین‌های چند سویه لاکتوباسیلوس بومی جدا شده از محصولات لبنی ایران

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده بیوتکنولوژی، تهران، ایران.

چکیده

  در این مطالعه سویه­های لاکتوباسیل جدا شده از فرآورده­های شیری سنتی ایرانی که برای تولید باکتریوسین بر علیه 8سویه استاندارد باکتری گرم مثبت، گرم منفی و مخمر با روش انتشاری غربالگری شدند. تعداد 8 سویه لاکتوباسیل بومی که از نظر تولید مناسب تشخیص داده شدند، انتخاب و از بین آنها 2 سویه جهت مطالعه بیشتر در نظر گرفته شدند. باکتریوسین­های تولید شده توسط 2 سویه فوق­الذکر با استفاده از رسوب­دهی با ایزوپروپانول و آمونیوم ­سولفات و سپس دیالیز و کروماتوگرافی تخلیص گردید. آزمایش ژل الکتروفوز وجود باکتریوسین­هایی با وزن مولکولی 45 تا 2/66 کیلودالتون را در این سویه­ها مشخص نمود. نتایج حاصله نشان داد سویه­های جدا شده بومی قادر به تولید مواد باکتریوسینی هستند که به میزان بیشتر علیه میکروکوکوس لوتئوس (Micrococcus luteus PTCC1169)، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیسStaphylococcus epidermidis) PTCC1435 ) و باسیلوس سرئوس (Bacillus cereus PTCC1247) و به مقدار کمتر بر روی لیستریا منوسیتوژنزListeria monocytogenes PTCC 1301)) مؤثر می­باشند. در بین میکروارگانیسم­های شاخص، میکروکوکوس لوتئوس به عنوان حساسترین باکتری و کاندیدا البیکنس (Candid albicans PTCC5027)به عنوان مقاوم­ترین ارگانیسم شناخته شدند. این مطالعه نشان داد، باکتریوسین­های تولید شده توسط این لاکتوباسیل­ها قادر به مهار طیف وسیعی از میکروارگانیسم­های بیماری­زای موجود در مواد غذایی می­باشند و می­توانند به عنوان نگه­دارنده­های بیولوژیک در فرآورده­های غذایی مورد استفاده قرار گیرند.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Screening and characterization of bacteriocins produced by some Strains of Lactobacillus spp isolated from Iranian Dairy products

نویسندگان [English]

  • S Mirdamadi
  • M Tangestani
- Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran
چکیده [English]

   In this study, the inhibitory effects of bacteriocins of lactobacilli which were isolated from Iranian traditional dairy products was determined against known gram positive, gram negative and yeast by well diffusion technique. Among 8 isolates with higher capability of bacteriocin production, 2 isolates were selected for further investigations. The bacteriocins were purified by iso-propanol and ammonium sulfate precipitation following by dialysis and chromatography technique. The molecular weight of bacteriocins was determined as 45 to 66/2 KDa. by SDS-page electrophoresis. According to the results, the produced bacteriocins had more inhibition effect on Micrococcus luteus PTCC1169, Staphylococcus epidermidis PTCC1435 as well as Bacillus cereus PTCC1247 and with lesser degree of extent on Listeria monocytogenes PTCC 1301. Results also revealed that, Micrococcus luteus  was the most sensitive bacterium among indicator bacteria, while Candid albicans PTCC 5027 identified as the most resistance organism. This research showed that, bacteriocins produced by lactobacilli isolated from traditional dairy products have high potency to be used against microbial pathogens and could be applied as bio-preservative in food products.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Lactobacilli
  • bacteriocin
  • Preservatives
  • Food Products
  • Nisin

 

شناسایی، جداسازی، تخلیص و بررسی طیف اثر باکتریوسین­های چند سویه لاکتوباسیلوس بومی جدا شده از محصولات لبنی ایران

 

سعید میردامادی1*، مهرنوش تنگستانی1

 

1- سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده بیوتکنولوژی، تهران، ایران.

*نویسنده مسئول مکاتبات: Mirdamadi@irost.org

(دریافت مقاله: 15/4/90   پذیرش نهایی: 7/9/90)

 

 

چکیده

  در این مطالعه سویه­های لاکتوباسیل جدا شده از فرآورده­های شیری سنتی ایرانی که برای تولید باکتریوسین بر علیه 8سویه استاندارد باکتری گرم مثبت، گرم منفی و مخمر با روش انتشاری غربالگری شدند. تعداد 8 سویه لاکتوباسیل بومی که از نظر تولید مناسب تشخیص داده شدند، انتخاب و از بین آنها 2 سویه جهت مطالعه بیشتر در نظر گرفته شدند. باکتریوسین­های تولید شده توسط 2 سویه فوق­الذکر با استفاده از رسوب­دهی با ایزوپروپانول و آمونیوم ­سولفات و سپس دیالیز و کروماتوگرافی تخلیص گردید. آزمایش ژل الکتروفوز وجود باکتریوسین­هایی با وزن مولکولی 45 تا 2/66 کیلودالتون را در این سویه­ها مشخص نمود. نتایج حاصله نشان داد سویه­های جدا شده بومی قادر به تولید مواد باکتریوسینی هستند که به میزان بیشتر علیه میکروکوکوس لوتئوس (Micrococcus luteus PTCC1169استافیلوکوکوس اپیدرمیدیسStaphylococcus epidermidis) PTCC1435 ) و باسیلوس سرئوس (Bacillus cereus PTCC1247) و به مقدار کمتر بر روی لیستریا منوسیتوژنزListeria monocytogenes PTCC 1301)) مؤثر می­باشند. در بین میکروارگانیسم­های شاخص، میکروکوکوس لوتئوس به عنوان حساسترین باکتری و کاندیدا البیکنس (Candid albicans PTCC5027)به عنوان مقاوم­ترین ارگانیسم شناخته شدند. این مطالعه نشان داد، باکتریوسین­های تولید شده توسط این لاکتوباسیل­ها قادر به مهار طیف وسیعی از میکروارگانیسم­های بیماری­زای موجود در مواد غذایی می­باشند و می­توانند به عنوان نگه­دارنده­های بیولوژیک در فرآورده­های غذایی مورد استفاده قرار گیرند.

 

واژه­های کلیدی:لاکتوباسیلوس، باکتریوسین، محافظت کننده، فرآورد­ه­های غذایی، نیسین

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

مقدمه

  در سالهای اخیر با مشخص شدن مضرات برخی از نگه­دارنده­های شیمیایی، محققین توجه خود را به ترکیبات نگه­دارنده طبیعی معطوف کرده اند زیرا نگه­داری مواد غذایی و کنترل کیفیت آن از نظر میکروبی یکی از مشکلات و چالش­های تولید کنندگان مواد غذایی است (Boziaris et al., 2006). بیماری­های منتقل شده از طریق مواد غذایی هنوز از اهمیت بالایی برخوردار است. از جمله شایع­ترین آنها می­توان به بیماری­های ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیاکولای، سویه های سالمونلا و لیستریا مونوسیتوژنز اشاره نمود. از مهمترین راه­های انتقال این باکتری­ها به انسان، مصرف مواد غذایی آلوده به این پاتوژن­ها به ویژه شیر و فرآورده­های آن می­باشد. مرکز کنترل بیماری­های آمریکا در سال 1999 اعلام کرد که سالیانه 76 میلیون مورد بیماری ناشی از مصرف غذا رخ می­دهد که حدود 5000 مورد آنها  به مرگ ختم می­شود (Cleveland et al., 2001). حتی یکی از عوامل سقط جنین و یا عقب ماندگی ذهنی نوزاد لیستریا مونوسیتوژنز گزارش می­شود که در ایران سرو تایپ­های عامل آن شناسایی گردیده است (Mirdamadi et al., 1994). این بیماری­ها سالیانه بین 5/6 تا 9/34 بیلیون دلار هزینه به آمریکا تحمیل می­کنند (Cleveland et al., 2001). در طی دهه گذشته مطالعات زیادی بر روی مواد ضد میکروبی مترشحه از باکتری­های  تخمیرکنندة مواد غذایی، صورت گرفته است تا در آینده ­بتوانند جایگزین نگه­دارنده­های شیمایی مانند دی اکسید سولفور، بنزوئیک اسید، سوربیک اسید، نیترات و نیتریت گردند (Mirdamadi et al.,  2007).

 

   درتخمیر که فرآیندی ناشی از فعالیت بیولوژیکی میکروارگانیسم­ها است ضمن رشد میکروارگانیسم­ها، متابولیت­های مختلفی تولید می­شود که برخی از آنها ضمن بی­خطر بودن برای مصارف انسانی، مانع رشد و زندگی میکروارگانیسم­های  ناخواسته در مواد غذایی می­شود. این مواد نگه­دارنده را محافظت­کننده­های بیولوژیکی (bio-preservative) می­نامند (Hugas, 1991).

  اگرچه باکتریوسین­ها توسط بسیاری از باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی تولید می­شوند اما از آنجایی که باکتری­های لاکتیک، بی­ضرر (GRAS) Generaly regarded as safe می­باشند، به طور کلی تمایل بیشتری برای استفاده از باکتریوسین­های آنها وجود دارد. باکتری­های لاکتیک (LAB) شامل نژادهای لاکتوکوکوس، استرپتوکوکوس، لاکتوباسیلوس و پدیوکوکوس­ها هستند که به علت توانایی گسترده­شان در تولید باکتریوسین­ها و نقش نگه­دارنده­ای که دارند، امروزه مورد توجه خاص پژوهشگران قرار گرفته­اند (Holzapfel et al., 1995). به علاوه، لاکتوباسیل­ها به دلیل توانایی­شان در تخمیر و نیز اهمیت­شان در سلامتی انسان، به عنوان پروبیوتیک­ها مورد توجه زیادی قرار گرفته­اند. آنها ترکیباتی مانند اسیدهای آلی، دی استیل، هیدروژن پراکساید و نیز باکتریوسین­ها را در طی تخمیر لاکتیک، تولید می­کنند که اثر حفاظتی آنها در مواد غذایی از اهمیت ویژه­ای برخوردارند (Mead et al., 1999; Mirdamadi et al., 2007; Tafreshi et al., 2010a).

   واژه باکتریوسین شامل گروه بزرگ و وسیعی از پروتئین­ها یا پپتیدهای ضدمیکروبی ریبوزومی خارج سلولی می­باشد که به عنوان مواد باکتری­کشی معرفی شده­اند که توسط باکتری­ها ساخته می­شوند و بر سویه­های مشابه یا سویه­های وابسته، اثر کشندگی یا مهارکنندگی دارند. آنها به طورکلی بر غشاء سیتوپلاسمیک اثرگذار هستند و با ایجاد نیروی حرکتی پروتون باعث تشکیل حفره­هایی در دو لایه فسفولیپیدی غشاء می­شوند. طیف فعالیت ضعیف آنها و مشخصة پروتئینی بودنشان، آنها را از آنتی بیوتیک­ها متمایز ساخته است (Mirdamadi et al.,  2009).

یکی از این باکتریوسین­ها نیسین است که به عنوان یک نگه­دارنده طبیعی از نظرFAO  وWHO تائید شده است و جزو ترکیباتGRAS  طبقه­بندی می­شود. این ماده باکتریوسینی در دماهای پاستوریزاسیون نسبتاً پایدار و دمای 95-85 درجه سلیسیوس را به مدت بیش از 20 دقیقه تحمل و حدود 15 درصد فعالیت آن کاهش می­یابد. استفاده توام از این نگه­دارنده با سایر عوامل ضد میکروبی باعث اثر بخشی بیشتر آن در افزایش ایمنی ماده غذایی بویژه در مقابل باکتری­های گرم منفی می­شودRauch et al., 1991)  Tafreshi et al., 2010b ; Mirdamadi et al., 2009;).

  با توجه به طیف اثر متفاوت باکتریوسین­ها و لزوم شناسایی ترکیبات جدید در این پژوهش با هدف شناسایی، جداسازی و تخلیص باکتریوسین­های سویه­های لاکتوباسیل بومی جدا شده از مواد لبنی طراحی و طیف اثر آنها جهت استفاده بالقوه به عنوان نگه­دارنده زیستی  (Bio preservative)سالم و بی­خطر بررسی گردید.

مواد و روش­ها

سویه­ها و محیط­های کشت

  سویه­های لاکتوباسیل مورد بررسی از نظر تولید باکتریوسین، لاکتوباسیل­های جداشده از محصولات لبنی بومی مناطق مختلف ایران بوده است که در فریزر 76- درجه سلیسیوس نگه ­داشته و در هنگام آزمایش در محیط MRS broth (MERCK)، به عنوان محیط کشت مایع برای رشد و بررسی تولید باکتریوسین، کشت داده می­شد.

 

بررسی طیف اثر

  بررسی طیف اثر باکتریوسین تولیدی بر روی سویه­های استاندارد بررسی گردید. سویه­های استاندارد مورد استفاده بعنوان سویه­های موردآزمایش شامل

Micrococcus luteus PTCC 1169; Bacillus cereus PTCC1247; Staphylococcus epidermidis PTCC 1435; Candida albicans PTCC 5027; Escherichia coli PTCC 1399; Staphylococcus aureus PTCC 1431: Listeria monocytogenes PTCC 1310; Entrococcus fecalis PTCC 1393

به صورت لیوفیلیزه از مرکز کلکسیون قارچ­ها و باکتری­های ایران، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهیه گردیدند.

 

تولید باکتریوسین

  سویه­های مولد در MRS broth کشت به مدت 48

 ساعت در37 درجه سانتی گراد و دور rpm 150 (دور در دقیقه) گرماگذاری شدند. به منظور کاهش فعالیت مهارکنندگی اسیدهای آلی تولید شده،  pH محیط تخمیری توسط سود 4 نرمال خنثی گردید همچنین برای حذف سلول­های باکتریایی، سانتریفیوژ در rpm 5000 به مدت 15 دقیقه ((Model:CLEMENTS انجام گردید و سوپرناتانت حاصله به منظور بررسی فعالیت باکتریوسینی، مورد ارزیابی قرار گرفت (Tafreshi et al., 2010b; Mirdamadi et al., 2009).

 

 

جداسازی پروتئین­ها (باکتریوسین­ها)

استفاده از 2-پروپانول

  سوپرناتانت حاصله به آرامی در مجاورت یخ با ایزوپروپانول سرد (MERCK)، با نسبت50 درصد  حجمی، مخلوط گردید. سپس نمونه­ها در rpm 15000 به مدت 40 دقیقه در 4 درجه سلیسیوس سانتریفیوژ ((BECKMAN model J2 شد. رسوب حاصله در بافر سیترات فسفات 1/0 مولار 5/4pH=، حل و از نظر فعالیت باکتریوسینی، مورد ارزیابی قرار گرفت.

 

استفاده از آمونیوم سولفات

   پروتئین­های موجود در مایع تخمیری فاقد سلول و خنثی شده، توسط سولفات آمونیم(MERCK) در4 درجه سلیسیوس رسوب داده شد. رسوب پروتئینی حاصله توسط سانتریفیوژ با دور rpm 15000 به مدت 40 دقیقه در 4 درجه سلیسیوس جدا و در بافر پتاسیم فسفات (7  pH= و 06/0 مولار) حل گردید و سپس فعالیت باکتریوسینی آن ارزیابی شد.

 

تخلیص پروتئین­ها (باکتریوسین­ها)

دیالیز

  نمونه حاصله از مرحله قبل به مدت 48 ساعت با  بافر پتاسیم فسفات (06/0 مولار (pH=7,، در 4 درجه سلیسیوس، تحت دیالیز قرار گرفت و سپس با استفاده از معرف نسلر حذف یونهای آمونیم از محلول، اثبات گردید. نمونه­ها برای اندازه­گیری فعالیت باکتریوسینی، علیه سویه­های حساس ارزیابی شدند.

 

کروماتوگرافی

  ستون با ژل سفادکس G-100 (Sephadex G-100 ,pharmacia ,Code No.17-0060-02) پر گردید و به عنوان فاز متحرک از بافر پتاسیم فسفات (7 pH= و06/0 مولار) استفاده شد. نمونه پروتئین روی ستون وارد و ستون توسط بافر شستشو گردید تا کلیه پروتئین­های متصل نشده از ستون خارج شوند.

   فراکنش­های خارج شده از ستون توسط فراکشن کالکتور جمع­آوری گردید و بخشی از آن برای تعیین فعالیت باکتریوسین و غلظت پروتئین استفاده و باقیماندة آن برای تغلیظ بیشتر، لیوفیلیزه گردید. پودر حاصل از لیوفیلیزه در  ml1 بافر استریل حل و برای تخلیص بیشتر استفاده شد.

 

 

 

الکتروفورز

   به منظور تعیین وزن مولکولی پروتئین­­ها از تکنیک الکتروفورز با تکنیک  SDS-PAGEو رنگ­آمیزی کماسی بلو مطابق دستورالعمل کاتالوگBIORAD ,Mini- PROTEAN 3 cell Instruction manual,cat.No.165-3301,165-3302 استفاده گردید. الکتروفورز روی ژل 17% پلی آکریلامید با حضور10% سدیم دودسیل سولفات، در یک ژل عمودی با ضخامت  mm5/1 و غلظتN' ,N متیلن بیس آکریلامید 30%، در حضور عوامل پلیمریزه کننده آمونیوم پرسولفات10% و TEMED انجام گرفت. ژل به مدت 10 دقیقه در جریان 60 ولت قرار داده شد و سپس الکتروفورز به مدت30 دقیقه در 120 ولت انجام شد.

 

تعیین فعالیت باکتریوسینی

  از روش ­ (well diffusion assay)سنجش چاهک برای اندازه گیری فعالیت باکتریوسین استفاده شد (Schillinger and Luke,1989) . در این روش 50 میکرولیتر از هریک از محلول­های باکتریوسینی بدست آمده در مراحل مختلف در چاهک­های ایجاد شده روی پلیت کشت که از قبل با یک لایه نازک از کشت مایع تست استرین بذردهی شده بودند، ریخته شد. به منظور دیفیوز مایع پروتئینی در ژل، پلیت­ها به مدت 30 دقیقه در یخچال 4 درجه سانتی گراد قرار گرفتند و سپس به مدت 24 ساعت در دمای مناسب رشد گرماگذاری شدند. قطر هاله عدم رشد تعیین و میزان فعالیت باکتریوسینی محاسبه گردید.

 

میزان واحد باکتریوسین تولیدی بر اساس بالاترین رقت نمونه که قدرت ایجاد هاله عدم رشد بر سویه استاندارد را دارد، تعریف گردیده است (Tafreshi et al., 2010a ; Mirdamadi et al., 2007 ).

 

یافته­ها

  در این تحقیق سویه­های لاکتوباسیل بومی از ماست و لبنیات مناطق مختلف ایران جداسازی و از نظر تولید باکتریوسین مقایسه گردیدند. از میان سویه­های بومی هشت سویه بیشترین باکتریوسین را تولید نمودند (جدول 1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1: قطر هاله­های عدم رشد متابولیت­های حاصل از کشت لاکتوباسیل­های مختلف (بر حسب میلی­متر)

L. monocytogenes

E.  fecalis

 

C. albicans

 

B. cereus

E. coli

S. epidermidis

S. aureus

M. loteus

تست استرین

سویه ها ی لاکتوباسیلو س

 

12

4

3

13

4

10

5

19

B43 Lactobacillus

1

10

3

3

9

3

9

8

25

B4      Lactobacillus

2

9

5

5

8

3

8

13

25

48       Lactobacillus

3

9

3

4

13

6

9

3

26

M 18    Lactobacillus

4

8

3

5

12

5

13

4

24

M31     Lactobacillus

5

9

4

4

14

4

11

11

23

M40     Lactobacillus

6

11

5

4

20

5

8

7

21

M46     Lactobacillus

7

10

4

3

17

6

8

5

25

M48     Lactobacillus

8

 

 

  پس از بررسی طیف اثر آنها دو سویه با نام­هایb4 و 48 برای بررسی­های بیشتر انتخاب گردید.

  دو سویه لاکتوباسیل بومی b4 و 48 تقریباً علیه تمام سویه­های استاندارد با قدرت متفاوت اثر مهاری داشتند و قوی­ترین سویه­ها از نظر تولید باکتریوسین بودند. همچنین M .luteus PTCC 1169  به عنوان حساس­ترین سویه وE. coli PTCC1399; Candida  albicans PTCC5027; E. fecalis PTCC1393  مقاوم­ترین تست­استرین­ها تشخیص داده شدند.

  هریک از لاکتوباسیل­ها الگوی مهار رشد متفاوتی علیه تست استرین­ها نشان دادند بطوریکه در شکل1 مشاهده می­گردد این باکتری­ها علاوه بر سویه میکروکوکوس لوتئوس بر باکتری اسپوردار باسیلوس سرئوس نیز اثر مهاری نشان دادند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1: هاله عدم رشد باکتریوسین های حاصل از لاکتوباسیل­ها بر سویه­های استاندارد باسیلوس سرئوس (شکل الف) و میکروکوکوس لوتئوس (شکل ب).

 

 

 

 

  جهت حذف اثر اسیدهای آلی، وبررسی خواص باکتریوسین تولیدی مراحل خالص سازی انجام گردید. برای جداسازی این مولکول­های پروتئینی از روش رسوب­دهی با سولفات آمونیوم و سپس بعد از دیالیز پروتئین­ها، نمونه­ها لیوفیلیزه و محصول در 15 میلی­لیتر بافر حل و برای ژل فیلتراسیون استفاده گردید. برای نمونه­های باکتریوسین سویه­های بومی b4 و 48 در هر مرحله تخلیص، مقدار پروتئین و فعالیت باکتریوسینی اندازه­گیری (جداول2 و3) و بطورکلی کاهش در مقدار پروتئین و افزایش فعالیت ویژه (Specific Activity) ما را به درصد تخلیص باکتریوسین رهنمون ساخت.

 

 

 

 

جدول 2 : مراحل مختلف و ضرایب تخلیص باکتریوسین حاصل از سویه b4

Purification Fold

Purification  Yield

(%)

 

Specific Activity (U/mg)

Total Protein  (mg)

Protein Concentration (mg/ml)

Total Activity

Activity (Unit/ml)

حجم نمونهml))

سویه b4

1

100

5/14

4/455

45/3

6600

50

132

مایع تخمیر

-

54/54

-

-

-

3600

100

36

قبل از دیالیز

48/14

6/35

08/210

71/10

238/0

2350

50

45

بعد از دیالیز

22/26

72/22

22/380

945/3

263/0

1500

100

15

نمونه لیوفیلیزه حل شده در بافر

4/157

3/13

2282

298/0

271/0

880

800

1/1

بعد از ژل فیلتراسیون

 

 

جدول 3 : مراحل مختلف و ضرایب تخلیص باکتریوسین حاصل از سویه 48

Purification Fold

Purification  Yield

(%)

 

Specific Activity U/mg))

Total Protein (mg)

Protein Concentration (mg/ml)

Total Activity

Activity unit/ml))

حجم نمونه(ml)

سویه 48

1

100

83/21

28/302

29/2

6600

50

132

مایع تخمیر

-

54/54

-

-

-

3600

100

36

قبل از دیالیز

58/5

81/31

95/121

22/17

41/0

2100

50

42

بعد از دیالیز

94/5

75/25

87/129

1/13

77/0

1700

100

17

نمونه لیوفیلیزه حل شده در بافر

08/458

6/16

10000

11/0

02/0

1100

1000

1/1

بعد از ژل فیلتراسیون

 

 

همانگونه که در نمودار (1 الف و ب) دیده می­شود، در این بررسی هریک از سویه­های مورد آزمایش در ژل فیلتراسیون، دو ناحیه جذبی در250 نانومتر

تشخیص داده شد که در مورد سویه 48 لوله­های شماره 11 تا 16 و در مورد سویه b4 لوله­های شماره 10 تا 15 فعالیت ضد رشد داشتند.

 

 

 

 

نمودار1 : منحنی بررسی خروج فراکشن­های پروتئینی از ستون­های ژل فیلتراسیون برای باکتریوسین­های سویه­های 48 (نمودار الف) و b4 (نمودارب)

 

شکل2، الکترفورز باکتریوسین­های حاصل از دو سویه را نشان می­دهد مقایسه باندها با مارکر نشان داد که وزن باکتریوسین­های موجود در این دو سویه­ها حدود 40 تا 50 کیلودالتون می­باشد .

 

 

شکل 2: الکتروفورز نمونه­های b4 (تصویر A) و 48 (تصویر B) به همراه مارکر وزن مولکولی. نمونه 1 تا 6 مربوط به تکرارهای متفاوت در مراحل مختلف تخلیص است.

 

 

بحث و نتیجه­گیری

  سویه­های مختلف باکتری­های اسید لاکتیک نظیر لاکتوباسیل­ها و لاکتوکوکوس­ها با تولید اسیدهای آلی از جمله اسید لاکتیک، تولید آنزیم­ها و متابولیت­های مختلف و از جمله باکتریوسین­ها توانایی بالایی جهت کنترل آلودگی­های مختلف میکروبی در مواد غذایی دارند (Rajaram et al., 2010). بسیاری از این باکتری­ها به عنوان پروبیوتیک­ها در حفظ سلامت انسان نقش به سزایی دارند. قدرت پروبیوتیک­ها در داشتن خواص فوق باعث گسترش تحقیقات در این زمینه گردیده است ((Mirdamadi et al., 2007. یکی از باکتریوسین­های مجازی که اکنون در صنعت غذا کاربرد فراوان یافته نیسین است. نیسین بوسیله لاکتوکوکوس لاکتیس تولید (Tafreshi et al., 2010a) و به عنوان یک نگه­دارنده بیولوژیک طبیعی در فرآورده­های غذایی استفاده می­گردد امروزه محققین با به دام­ اندازی نیسین در نانو ساختارهای بیولوژیک، فرمول­های آهسته رهش آنرا برای مواد غذایی تخمیری طراحی نموده­اند (Zohri et al., 2009; Mirdamadi et al., 2009). با وسیع­تر شدن دامنه استفاده از این باکتریوسین و گسترش مقاومت سویه­های میکروبی به مواد ضد رشد، محققین به فکر شناسایی باکتریوسین­های جدید دیگر افتاده و تحقیقات زیادی جهت شناسایی و تولید این مواد طبیعی در کشور­های مختلف دنیا در جریان است Anas et al., 2008 (Mirdamadi et al., 2007, Poor Ahmad et al., 2006; (Rajaram et al., 2010. از ویژگی­های مهم این باکتریوسین­ها طیف اثر گسترده آن می­باشد. همانگونه که ذکر شد، در این تحقیق سویه­های لاکتوباسیل بومی از ماست و لبنیات مناطق مختلف ایران جداسازی و از نظر تولید باکتریوسین مقایسه گردیدند. از میان هشت سویه که بیشترین باکتریوسین را تولید نمودند (جدول1). دو سویه با نام­هایb4 و 48 با طیف اثر وسیع انتخاب و باکتریوسین تولیدی آنها خالص گردید.

  هریک از لاکتوباسیل­ها الگوی مهار رشد متفاوتی علیه سویه­های مورد آزمایش نشان دادند (شکل1). دو سویه لاکتوباسیل بومی b4 و48 تقریبا  علیه تمام سویه­های استاندارد با قدرت متفاوت اثر مهاری داشتند و قوی­ترین سویه­ها از نظر تولید باکتریوسین بودند. همچنین M .luteus PTCC 1169 به عنوان حساس­ترین سویه وE. coli PTCC1399;  Candida  albicans PTCC5027;  E. fecalis PTCC1393  مقاوم­ترین تست استرین­ها تشخیص داده شدند. عدم تاثیر قوی این باکتریوسین­ها بر روی باکتر­ی­های گرم منفی مشابه نیسین می­باشد. نیسین روی باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس، ل