تولید نیمه صنعتی اسید لاکتیک بوسیله سویه Lactobacillus casei subsp. casei

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسنده

سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده بیوتکنولوژی، تهران، ایران

چکیده

   در این تحقیق مراحل تولید نیمه صنعتی اسید لاکتیک در فرمانتورهای همزن­دار و به منظور طراحی خط صنعتی تولید اسیدلاکتیک با درجه خلوص مورد استفاده در صنایع غذایی مورد ارزیابی قرار گرفت. برای این ­کار چهار سویه میکروبی استاندارد
(Staphylococcus aureus PTCC 1113،Microccoccus luteus PTTC 1110، Escherichia coli PTCC 1330وListeria monocytogenes PTCC 1304) انتخاب و حداقل غلظت مهار کننده رشد برای هر یک بررسی گردید و تغییر منحنی رشد هر سویه در حضور و عدم حضور اسید لاکتیک و لاکتات کلسیم مقایسه شد.به منظور بدست آوردن دانش فنی تولید اسید لاکتیک، مراحل افزایش حجم تولید و تخلیص توسطسویهPTCC 1608   Lactobacillus casei subsp. Caseiدر دو فرمانتور همزن­دار20 و750 لیتری انجام شد. محیط تولید بهینه­سازی شده با منابع کربن متفاوت (گلوکز، لاکتوز و آب پنیر) و پودر خیسانده ذرت به عنوان منبع نیتروژن و به دو روش کشت غیر مداوم و کشت نیمه مداوم انجام شد. جهت تخلیص اسید لاکتیک از روش کلاسیک استفاده شد. پس از
بهینه­سازی محیط کشت،این سویهدر بررسی­های آزمایشگاهی در گرم­خانه همزن­داربیشترین تولید را در محیط حاوی g/l80 گلوکز و g/l50 آب پنیر داشت. در این سیستمg/l 69/72 لاکتات کلسیم با بهره­وری  g/lh51/0 و بازده 56% تولید شد. در فرمانتور20 لیتری در تخمیر نیمه مداوم، در مدت زمان 44 ساعت  g/l75/108 لاکتات کلسیم تولید شد. در این شرایط بازده واکنش 83% ولی بدلیل کاهش زمان تولید افزایش قابل توجهی دربهره­وری (g/lh47/2) مشاهده گردید. سپس در فرمانتور750 لیتری در کشت نیمه مداوم  g/l350 لاکتات کلسیم با بهره­وری g/lh 4/5 تولید شد. 

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Pilot Plant Production of Lactic acid by Lactobacillus casei subsp. casei

نویسنده [English]

  • S.S Mirdamadi
Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran.
چکیده [English]

The aim of present study, was to scale up the production of L (+) lactic acid from the laboratory to pilot plant using Lactobacillus casei subsp. casei PTCC 1608. Moreover, the minimum inhibitory concentration of the produced lactic acid and sodium lactate against 4 test strains including Staphylococcus aureus PTCC 1113, Microccoccus luteus PTTC 1110, Escherichia coli PTCC 1330 and Listeria monocytogenes PTCC 1304 were evaluated. According to the results, the specific growth rate of each test strain was decreased by lactic acid. The inhibitory effect of the sodium lactate was lower than lactic acid in all of the experiments. The best carbon (glucose, lactose and whey) and nitrogen (corn steep powder) sources were optimized in batch and fed batch system and also pH, temperature and aeration were improved in shake flask incubator, 20 l and 750 l stirred tank reactors (STR). Glucose (80 g/l) supplemented with (50 g/l) whey was found as the best production medium.Productivity and yield of calcium lactate production in laboratory scale were 0.51 g/lh and 0.56%, respectively. Fed batch production of calcium lactate in 20 l bioreactor increased the productivity and yield up to 2.47 and 0.83%. Production and productivity was increased up to 350 g/l and 5.4 g/lh, respectively in scaled up processes by 750 liters bioreactor (STR).

کلیدواژه‌ها [English]

  • lactic acid
  • L. casei
  • Preservative
  • Stirred tank reactor
  • Fermentation

تولید نیمه صنعتی اسید لاکتیک  بوسیله سویه  Lactobacillus casei subsp. casei

 

سید سعید میردامادی*

 

سازمان پژوهش­های علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده بیوتکنولوژی، تهران، ایران.

*نویسنده مسئول مکاتبات:  Mirdamadi@irost.org

(دریافت مقاله: 12/4/90  پذیرش نهایی: 16/3/91)

  

 

چکیده

   در این تحقیق مراحل تولید نیمه صنعتی اسید لاکتیک در فرمانتورهای همزن­دار و به منظور طراحی خط صنعتی تولید اسیدلاکتیک با درجه خلوص مورد استفاده در صنایع غذایی مورد ارزیابی قرار گرفت. برای این ­کار چهار سویه میکروبی استاندارد
(
Staphylococcus aureus PTCC 1113،Microccoccus luteus PTTC 1110، Escherichia coli PTCC 1330وListeria monocytogenes PTCC 1304) انتخاب و حداقل غلظت مهار کننده رشد برای هر یک بررسی گردید و تغییر منحنی رشد هر سویه در حضور و عدم حضور اسید لاکتیک و لاکتات کلسیم مقایسه شد.به منظور بدست آوردن دانش فنی تولید اسید لاکتیک، مراحل افزایش حجم تولید و تخلیص توسطسویهPTCC 1608   Lactobacillus casei subsp. Caseiدر دو فرمانتور همزن­دار20 و750 لیتری انجام شد. محیط تولید بهینه­سازی شده با منابع کربن متفاوت (گلوکز، لاکتوز و آب پنیر) و پودر خیسانده ذرت به عنوان منبع نیتروژن و به دو روش کشت غیر مداوم و کشت نیمه مداوم انجام شد. جهت تخلیص اسید لاکتیک از روش کلاسیک استفاده شد. پس از
بهینه­سازی محیط کشت،
این سویهدر بررسی­های آزمایشگاهی در گرم­خانه همزن­داربیشترین تولید را در محیط حاوی g/l80 گلوکز و g/l50 آب پنیر داشت. در این سیستمg/l 69/72 لاکتات کلسیم با بهره­وری  g/lh51/0 و بازده 56% تولید شد. در فرمانتور20 لیتری در تخمیر نیمه مداوم، در مدت زمان 44 ساعت  g/l75/108 لاکتات کلسیم تولید شد. در این شرایط بازده واکنش 83% ولی بدلیل کاهش زمان تولید افزایش قابل توجهی دربهره­وری (g/lh47/2) مشاهده گردید. سپس در فرمانتور750 لیتری در کشت نیمه مداوم  g/l350 لاکتات کلسیم با بهره­وری g/lh 4/5 تولید شد.

 

واژه­های کلیدی: اسید لاکتیک، لاکتوباسیلوس کازئی، فرمانتور همزن­دار، تخمیر، افزایش حجم تولید

 

 

 

مقدمه

   توسعه صنایع غذایی لزوم استفاده از پاره­ای مواد شیمیایی را ایجاب می­کند که دسته­ای از آنها را افزودنی­ها تشکیل می­دهند. نقش اصلی افزودنی­ها، به منظور افزایش ارزش غذایی، خواص حسی، حفاظت و نگه­داری مواد غذایی است. پیشرفت­های اخیر در افزودنی­های مواد غذایی، تولید افزودنی­های طبیعی با استفاده از علم بیوتکنولوژی می­باشد، که روش تأمین سلامتی و سالم و بدون خطر بودن آن (GRAS) به اثبات رسیده است. از طرفی محدودیت کاربردهای افزودنی­های شیمیایی به دلیل اثرات جانبی متعدد باعث شده است که کشورهای پیشرفته به سمت تولید افزودنی­های طبیعی از طریق بیوتکنولوژی روی آورند. (Mirdamadi et al., 2009; Tafreshi et al., 2010). از جمله این افزودنی­ها که سالیان درازی است در کشورها استفاده می­گردد، اسید لاکتیک، نمک­های لاکتیک، و فرآورده­های حاصل از تخمیر باکتری­های لاکتیکی نظیر نیسین است (Mirdamadi et al., 2007; Mirdamadi et al., 2009; Tafreshi et al., 2010). اسید لاکتیک که با نام­های 2- هیدروکسی پروپیونیک اسید و 2- هیدروکسی پروپانوئیک اسید نیز معرفی می­شود یک اسید آلی هیدروکسیـل­دار ضعیف با فرمول شیمیایی CH3CHOHCOOH است. این اسید با دارا بودن دو ایزومر نوری D(-) و L(+) کاربردهای زیادی در صنایع پزشکی، دارویی، غذایی و شیمیایی دارد (John, 1996; Mirdamadi et al., 2002; Mirdamadi, 2007).

   اولین بار در سال 1780 در شیر ترش شده، توسط Scheele گزارش و Schulze در سال 1868 وجود باکتری­های اسید لاکتیک را در مایه­های کشت کارخانه­های تقطیر نشان داد و سویه L. delbreckii   را برای تولید تجاری اسید لاکتیک به کار برد. این اسید دارای فعالیت نوری است و تنها ایزومر نوری (+)L آن در انسان متابولیزه می­گردد. موارد عمده کاربرد اسید لاکتیک و مشتقات آن مربوط به صنایع غذایی، دارویی و صنایع مختلف شیمیایی می­شود. از مهم­ترین و جدیدترین کاربرد آن در صنایع غذایی و پزشکی تهیه پلاستیک­های زیست تخریب از جمله پلی لاکتیک اسیدها(PLA)، کوپلیمرهای پلی­لاکتیک اسید و
پلی­گلیکولیک اسید (PLA-PGA) است که در موارد بالینی و ساخت ابزار آلات پزشکی نظیر نخ­های بخیه،
ابزارآلات پیوندی، داروهای آهسته رها شونده از آن استفاده می­شود (John, 1996; Mirdamadi et al., 2007; Mirdamadi et al., 2008).

   اسید لاکتیک به دو طریق بیولوژی (فرآیندهای تخمیری) و شیمیایی تولید می‌شود. امروزه بیشترین حجم تولید اسید لاکتیک در جهان به دلیل نیاز به تولید ایزومر (+)L و عدم کفایت نوع سنتز شده بصورت شیمیایی که بصورت مخلوطی از دو ایزومر نوریL(+)  وD(-)  می­باشد، بصورت تخمیر است (Zyed and Winter, 1995; Mirdamadi et al., 2007). طبق گزارشات (CEH) Chemical Economics Handbook، در سال 2002 تولید جهانی اسید لاکتیک، نمک­ها و استرهای آن 8/201 هزار تن بوده است. 88 درصد مصرف جهانی آن در موارد صنعتی بخصوص صنایع غذایی است و با متوسط نرخ رشد سالیانه 7/9 درصد، پیش­بینی شد که در سال 2007 تولید جهانی آن  به 5/320 هزار تن در سال رسیده و ادامه یابد (Bizzari, 2003). کمپانی PURAC در آمریکا با تولید 34000 تن اسید لاکتیک در سال به روش مداوم  (Continuous)یکی از بزرگترین تولیدکننده­های تخمیری اسید لاکتیک در جهان است که کارخانه­های متعددی در آمریکای لاتین و آمریکای جنوبی و اروپا دارد. از سویهL. bulgaricus   برای تولید استفاده
می­کند (Bray, 1998).

   در این پژوهش،  PTCC 1608casei .L. casei ssp به دلیل راندمان بالا، زمان تولید کوتاه و تولید نزدیک به صد در صد نوع (+)L اسید لاکتیک به عنوان سویه تولیدکننده لاکتات­ها استفاده شد. سپس بهینه­سازی شرایط تخمیر و ترکیبات محیط کشت جهت افزایش حجم تولید در فرمانتورهای20 و750 لیتر (Scale up)، افزایش راندمان و میزان تولید در واحد زمان، تولید اقتصادی اسید لاکتیک در حجم نیمه صنعتی و بررسی کاربرد آن بصورت تنها و یا ترکیب با دیگر افزودنی­ها مورد ارزیابی قرار گرفته است.

 

مواد و روش­ها

 

   میکروارگانیسم­ها: آمپول لیوفیلیزه سویه­های استاندارد(Test strain)  Staphylococcus aureusPTCC 1113،Microccoccusluteus PTTC 1110  ،Escherichia coli PTCC 1330  ،Listeria monocytogenes PTCC 1304 و سویه مولد اسید لاکتیک Lactobacillus  casei  ssp. casei PTCC 1608 از بخش کلکسیون میکروبی سازمان پ‍‍ژوهش­های علمی و صنعتی ایران دریافت شد. این آمپول­ها در شرایط کاملاً استریل باز و بر روی محیط­های اختصاصی شیب­دار کشت داده شدند. لوله­های
تلقیح­شده در دمای مناسب گرم­خانه­گذاری شدند. لاکتوباسیلوس کازیی در محیط  MRS Agar((Man, Rogosa and Sharpe و باکتری­های دیگر در محیطNutrient agar  کشت داده شدند. (Mirdamadi et al., 2007; Mirdamadi et al., 2002; Tafreshi et al., 2010).

   محیط کشت رشد و تهیه پیش کشت لاکتوباسیلوس کازئی: آمپول لیوفیلیزه در شرایط کاملاً استریل باز و بر روی محیطMRS Agar  شیب­دار کشت داده شد.
 لوله­های تلقیح­شده در جار CO2 و در دمای ˚C 37 به مدت 48 ساعت گرماگذاری شدند. برای تهیه
پیش­کشت ازمحیط مایع MRS استفاده شد و بعد از تلقیح کشت­های باکتری­ها درفلاسک حاوی محیط درشرایط ˚C30 و180 دور در دقیقه به مدت 36 ساعت در
گرم­خانه همزن­دار گرماگذاری شدند (Mirdamadi et al., 2007; Mirdamadi et al., 2008).

   فرمولاسیون محیط کشت تولید اسید لاکتیک: با توجه به اهمیت منبع کربن در تولید اسید لاکتیک، محیط کشت طراحی شده با مقادیر و منابع متفاوت کربن بهینه گردید. محیط بهینه عبارت بود از (g/l): گلوکز 130، پودر خیسانده ذرت 20، استات سدیم 1، سولفات منیزیوم 2/0، سولفات منگنز 03/0، سولفات آهن 03/0، pH  محیط حدود 1/0± 6 تنظیم گردید.

    در طول تخمیر، تعدیل نمودن pH محیط تولید با افزودن محلول هیدروکسیدکلسیم استریل و به صورت پیوسته صورت گرفت (Hofvendahl, 2000 and  Hahn-Hagerdal).

   شرایط تخمیر: باکتری­های پیش­کشت تهیه شده در محیط مایعMRS  به میزان  CFU/ml108 سلول باکتری و به نسبت 10% (v/v) در محیط تولید تلقیح شد. شرایط بهینه تخمیر دمای ˚C 42، 500 دور در دقیقه و سیستم بی­هوازی بود. میزان تولید لاکتات کلسیم در زمان­های مختلف اندازه­گیری شد(Mirdamadi et al., 2008 ).

   فرمانتور: جهت بررسی اثرات افزایش حجم تولیداز فرمانتور همزن­دار 20 لیتری ساخت کمپانی Chemap آمریکا و فرمانتور750 لیتری ساخت کمپانی MBR سوئیس استفاده شد.

 بازیافت اسید لاکتیک:لاکتات کلسیم حاصل از تخمیر توسط اسید سولفوریک 63% به اسید لاکتیک تبدیل گردید. در این مرحله ابتدا در10 لوله آزمایش، هر کدام ml  10 از مایع حاصل از مرحله قبل ریخته شد. سپس به هر کدام  مقادیر متفاوت اسید سولفوریک 63% اضافه شد تا تیتر مناسب اسید سولفوریک جهت تبدیل لاکتات کلسیم به اسید لاکتیک مشخص گردد (Zyed and Winter,1995).

   جداسازی رسوبات:رسوبات و ژیبس تولید شده توسط فیلتر پرس جداسازی شدند.

   رنگبری: از زغال فعال جهت رنگبری استفاده شد. مقدار زغال فعال، زمان ماند در مجاورت زغال فعال، تأثیر همزدن مایع و دما برای رنگبری بررسی و
بهینه­سازی شد.

   روش اندازه­گیری اسید لاکتیک:اندازه­گیری اسید لاکتیک به روش رنگ سنجی انجام شد. با اضافه نمودن اسید سولفوریک غلیظ به اسید لاکتیک و حرارت در بن ماری جوش بعد از 10 دقیقه، استالدئید حاصل شد. استالدئید در حضور سولفات مس 4% و پارافنیل فنل (5/1% در اتانول)، بعد از 30 دقیقه کمپلکس رنگی ایجاد کرد که میزان جذب نوری آن درطول موج nm 570 اندازه­گیری شد (Mirdamadi et al., 2008).

   اندازه­گیری کیفیت اسید لاکتیک تولیدی: جهت بررسی کیفیت اسید لاکتیک تولید شده نمونه­ها با ستونC18  به روشanalytical reverse phase HPLC  مورد ارزیابی قرار گرفت ((Mirdamadi et al., 2009.

    روش اندازه­گیری گلوکز باقیمانده در محیط کشت:غلظت گلوکز به روش آنزیمی اندازه­گیری شد. واکنش­های انجام شده در این آزمایش بدین ترتیب است که گلوکز توسط آنزیم گلوکز اکسیداز به گلوکونیک اسید و آب اکسیژنه تبدیل می­گردد. آب اکسیژنه تحت تأثیر آنزیم پر اکسیداز و در حضور فنل و 4- آمینوآنتی پیرین به کینون قرمز رنگی تبدیل می­شود که رنگ ایجاد شده نسبت مستقیم با مقدار گلوکز موجود در نمونه دارد. که بعد از 20 دقیقه کمپلکس رنگی ایجاد شده درطول موج  nm500 بررسی و مقدار گلوکز نمونه بر اساس منحنی استاندارد اندازه­گیری شد (Bruno-Barcena, 1999; Bergmeyer, 1974; Mirdamadi et al., 2007).

تعیین حداقل غلظت بازدارنده (MIC): از مواد
نگه­دارنده در محیط کشت رقت متوالی تهیه شد. باکتری­ها در محیط اختصاصی کشت و پس از رشد 100 میکرولیتر از کشت حاوی 108 عدد در میلی لیتر (CFU/ml) به محیط کشت حاوی ماده نگه­دارنده افزوده شد. پس از 24 ساعت گرم­خانه­گزاری، رشد در لوله­ها بررسی گردید. آخرین لوله عدم رشد به عنوان حداقل غلظت بازدارنده رشد انتخاب گردید.

رسم منحنی رشد: میکروارگانیسم­ها در محیط اختصاصی فاقد نگه­دارنده و حاوی نگه­دارنده با حداقل غلظت بازدارنده کشت و برای باکتری­ها میزان رشد بر اساس جذب در 600 نانومتر در ساعت­های متوالی محاسبه و منحنی رشد در هر حالت رسم گردید.

مواد: کلیه مواد شیمیایی و محیط­های کشت تجاری استفاده شده در این تحقیق از کمپانی­های Merck, Fluka و PanReac بود.

 

 

 

یافته­ها

   در بررسی­های آزمایشگاهی، پس از بهینه­سازی محیط کشت، سویه L. casei ssp. casei بیشترین تولید را در محیط حاوی 80 گرم در لیتر گلوکز و 50 گرم در لیتر آب پنیر داشت. در این سیستم 69/72 گرم در لیتر لاکتات کلسیم با بهره­وری  g/lh51/0 و بازده 56% تولید شد. سپس با هدف افزایش حجم تولید، تخمیر در دو فرمانتور همزن­دار 20 و 750 لیتری به دو روش کشت غیرمداوم و نیمه مداوم انجام شد.

   در فرمانتور همزن­دار (STR) 20 لیتری، محیط تولید بهینه سازی شده با پودر خیسانده ذرت به عنوان منبع نیتروژن و نیز شرایط تخمیر بهینه دمای ˚C 42، 500rpm: و سیستم بی­هوازی مورد استفاده قرار گرفت. ابتدا محیط تولید با g/l130 لاکتوز استفاده شد. بعد از گذشت 141 ساعت، g/l 91/73 لاکتات کلسیم
(بهره­وری: g/lh 52/0 و بازده: 56% تولید شد (شکل 1).

در آزمایش بعدی از گلوکز به میزان g/l130 به عنوان منبع کربن استفاده شد. لاکتات کلسیم  g/l22/95 بعد از 140 ساعت تولید شد که بهره­وری   g/lh68/0 و بازده واکنش 73% بود (شکل 1).  

    سپس از آب پنیر (Whey) برای ساخت محیط تولید به میزان g/l50 به همراه g/l 80 لاکتوز استفاده شد. در این شرایط بعد از 68 ساعت میزان تولید لاکتات کلسیم به g/l 110 افزایش یافت و بهره­وری  g/lh62/1 و بازده به 85% رسید (شکل1).

 

 

 

شکل 1: میزان تولید لاکتات کلسیم در واحد زمان در محیط تولید با منابع کربن متفاوت

 

 

   پس از موفقیت تولید در فرمانتور 20 لیتر شرایط تولید اسید لاکتیک در فرمانتور همزن­دار (STR) با حجم 750 لیتر با دو شرایط کشت غیرمداوم (batch) و
خوراک­دهی نیمه مداوم (feed batch) بررسی شد. مقایسه میزان تولید در کشت غیرمداوم و نیمه مداوم نشان داد که افزایش تدریجی سوبسترا بصورت نیمه مداوم اثر افزاینده در تولید دارد (شکل 2).

 

          

 

 

 

 

 شکل2: مقایسه دو روش تخمیر غیرمداوم و نیمه مداوم درمحیط تولید در شرایط آزمایشگاهی تا نیمه صنعتی

 

 

 

 

 

در کشت­های خوراک­دهی غیرمداوم زمان خوراک­دهی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. تنظیم دقیق زمان از اثر کاهنده افزایش غلظت سوبسترا بدلیل خاصیت اسمز و کاهش آب فعال جلوگیری می­شود. شکل 3 ضمن مشخص کردن زمان خوراک­دهی در سیستم نیمه مداوم، میزان تولید را در دو سیستم و در فرمانتور 750 لیتر مقایسه می­نماید.

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

شکل3- تولید لاکتات کلسیم در فرمانتورL 750 به روش تخمیر غیرمداوم و  نیمه مداوم

 

 

   افزایش حجم تولید (Scale up) یکی از مراحل مهم تولید صنعتی است که در فرمانتور 750 لیتر انجام و در شرایط غیرمداوم  g/l120 لاکتات کلسیم با بهره­وری g/lh 8/2 و بازده 92% به دست آمد در حالیکه در کشت نیمه مداوم g/l350 لاکتات کلسیم با بهره­وری  g/lh4/5 تولید شد.

   نتایج میزان تولید لاکتات کلسیم و بهره­وری در تخمیر نیمه مداوم در فرمانتور 750 لیتر در جدول 1 نشان داده شده است.

 

 

جدول1- میزان تولید لاکتات کلسیم و بهره وری در تخمیر نیمه مداوم در فرمانتور750 لیتر

زمان (ساعت)

21

31

42

58

65

لاکتات کلسیم

(گرم در لیتر)

55

92

155

296

350

بهره­وری

)گرم در لیتر ساعت(

6/2

3

4/3

5

4/5

 

 

   قابل ذکر است پس از انجام مرحله تخمیر، فرآیندهای بعد از تولید در حد نیمه صنعتی آغاز شد. با افزودن اسید سولفوریک 63% سولفات به همراه کلسیم به صورت ژیبس رسوب می­نماید و اسید لاکتیک آزاد می­گردد. رسوبات ژیبس و پروتئین­های تغلیب­شده توسط فیلتر پرس حذف و اسید لاکتیک حاصل در تانک­های نگه­دارنده جمع­آوری گردید. بدلیل
واکنش­های شیمیایی متعدد نظیر واکنش میلارد، کاراملیزه شدن کربوهیدارات­های باقیمانده و مواد رنگی موجود در مواد اولیه، اسید حاصل حاوی ترکیبات زرد رنگ بود که توسط زغال فعال رنگبری گردید. جدول 2 مراحل تخلیص و میزان بازیافت محصول در هر مرحله را نشان می­دهد.

 

 

جدول2- مراحل تخلیص و میزان بازیافت اسید لاکتیک تولید شده در فرمانتور 20 لیتر

نمونه

حجم

(لیتر)

مقدار لاکتات

(گرم)

درصد بازیافت

مایع تخمیر

16

2624

100

رسوبدهی پروتئین­ها

8

36/2613

6/99

افزودن اسید سولفوریک و جداسازی ژیبس

8

2473

25/94

تغلیظ

3

1906

88

رنگبری

3

1900

7/87

 

   بعد از پایان تخمیر در فرمانتور L 750، و اجرای مراحل تخلیص از حدود 100 لیتر مایع تخمیر نهایی دارای 350 گرم در لیتر لاکتات کلسیم، حدود 80 لیتر اسید لاکتیک 270 گرم در لیتر حاصل شد.

 جهت بررسی کیفیت اسید لاکتیک تولید شده، نمونه­ها به روش HPLC با ستونC18  مورد ارزیابی قرار گرفت (شکل4).  

 

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل4: نتایج  HPLC جهت بررسی کیفیت اسید لاکتیک تولید شده

 

 

   با توجه به کاربردهای مختلف این ترکیبات در صنایع غذایی، اثر بازدارندگی هر یک از ترکیبات اسید لاکتیک و لاکتات کلسیم مورد ارزیابی قرار گرفت. در جدول شماره 3 طیف اثر اسید لاکتیک و لاکتات کلسیم حاصل در مقایسه با بازدارنده­های دیگر مقایسه گردید.

 

جدول 3: تعیین حداقل غلظت بازدارنده مواد نگه­دارنده درمیلی لیتر محیط کشت در شرایط بهینه

ماده نگه­دارنده

لیستریا منوسیتوژنز

میکروکوکوس لوتئوس

اشریشیا کولای

استافیلوکوکوس ارئوس

اسید لاکتیک

10-4

10-5

10-4

10-4

لاکتات کلسیم

10-3

10-3

10-3

10-3

بنزوات سدیم

10-5

10-5

10-4

10-4

نیترات سدیم

10×5-3

10×5/2 -3

10×5-3

10×5-3

نیتریت سدیم

10× 2-4

10× 2-4

× 25/610-4

× 25/610-4

 

 

   بررسی اثر مهاری ترکیبات لاکتات با بررسی اثر بر ضریب رشد میکروارگانیسم­های استاندارد قابل بررسی و استانداردسازی می­باشد. لذا اثر اسید لاکتیک و نمک لاکتات آن بر ضریب رشد میکروارگانیسم­های استاندارد مهم در صنایع غذایی بررسی گردید (شکل 5).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

               
 

زمان (ساعت)

 
   

زمان (ساعت)

 
 
 
   

زمان (ساعت)

 
   

زمان (ساعت)

 
 

 

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل5: اثر اسید لاکتیک و نمک لاکتات بر ضریب رشد برخی میکروارگانیسم­های مهم در صنعت غذا

 

 

بحث و نتیجه­گیری

   از آنجا که تنها ایزومر نوری (+)L اسید لاکتیک در بدن انسان متابولیزه می­گردد و سویه مولد باید تنها این ایزومر نوری را تولید نماید. سویهL. casei ssp. casei به دلیل توان بالای تولید اسید لاکتیک، متابولیسم هموفرمانتاتیو و تولید ایزومر نوری نسبتاً خالص (+)L  جهت تولید اسید لاکتیک انتخاب گردید (Bruno-Barcena et al., 1999; Gieese, 1994; Mirdamadi et al., 2007). از طرفی با توجه به هدف این تحقیق که صنعتی سازی تولید اسید لاکتیک بود، و در تولید در حجم نیمه صنعتی و صنعتی استفاده از سوبستراهای ارزان و در دسترس ضروری است (Anuradha et al., 1999)، ما در این تحقیق از مواد اولیه در دسترس نظیر گلوکز صنعتی، لاکتوز صنعتی، آب پنیر به عنوان منبع لاکتوز (Fitzpatrick et al., 2001)، خیسانده ذرت (پساب کارخانه­های استخراج نشاسته از ذرت) استفاده نمودیم.

   در حال حاضر، از سوکروز بدست آمده از ساقة نیشکر و چغندر ‌قند، لاکتوز موجود در آب ‌پنیر (cheese whey)، مالتوز و دکستروز حاصل از هیدرولیز نشاسته به صورت تجاری در فرآیند‌های تولید اسید‌لاکتیک استفاده می‌شود. نتایج آزمایش­های ما نشان داد که لاکتوز و گلوکز از مناسب­ترین سوبستراها برای تولید اسید لاکتیک از این سویه است. بنابراین سوبستراهای لاکتوز، گلوکز و آب پنیر تقویت شده با هر یک از این دو سوبسترا به عنوان بهترین منبع انتخاب و پس از بهینه­سازی نشان داده شد گلوکز در این سویه دارای راندمان بالاتری در تولید اسید لاکتیک می­باشد.

   معمولاً منابع نیتروژن‌داری نظیر جوانه جو، عصارة جو، عصاره ‌خیسانده‌ ذرت (corn steep liquor)، عصاره مخمر یا شیر دلمه نبسته به عنوان منبع ازت و به منظور ایجاد رشد سریع و انبوه میکروارگانیسم‌ها به محیط کشت اضافه می­نمایند. در این راستا ما عصاره خیسانده ذرت را به عنوان یک سوبسترای ارزان، در دسترس و صنعتی مورد استفاده قراردادیم. با توجه به اینکه عصاره خیسانده ذرت دارای املاح و ویتامین­های متعددی است Anuradha et al., 1999)) از حداقل عناصر دیگر جهت تکمیل محیط تولید استفاده گردید.

   پس از بهینه­سازی محیط کشت، در بررسی­های افزایش حجم تولید در دو فرمانتور همزن­دار 20 و 750 لیتری به دو روش کشت غیرمداوم و نیمه مداوم انجام شد. در افزایش تولید استفاده از سوبسترای ارزان قیمت از اصول تولید صنعتی می­باشد. لذا در فرمانتور همزن­دار (STR) 20 لیتری، محیط تولید بهینه­سازی شده با پودر خیسانده ذرت به عنوان منبع نیتروژن و سیستم
 بی­هوازی بهینه گردید. در شرایط وجود لاکتوز
بهره­وری g/lh  52/0 و بازده: 56% حاصل شد. در آزمایش بعدی از گلوکز به عنوان منبع کربن استفاده شد. در این حالت میزان بهره­وری و بازده افزایش و به ترتیب به  g/lh68/0 و 73% رسید. پس از استاندارسازی شرایط با سوبسترای استاندارد از آب پنیر (Whey) برای ساخت محیط تولید استفاده شد. در این شرایط بدلیل وجود ترکیبات مناسبی نظیر برخی ویتامین­ها و املاح در آب پنیر بهره­وری، g/lh   و بازده به شدت افزایش و به 62/1 و 85% رسید (شکل 1).

   همان طور که مقایسه نمودارها در شکل 1 نشان
می­دهد، هرچند لاکتوز سوبسترای بسیار مناسبی برای لاکتوباسیل­ها است اما استفاده از گلوکز به عنوان منبع کربن باعث افزایش تولید و بهره­وری شده است و لازم به ذکر است، استفاده ازلاکتوز و آب پنیر که ماده تقویت کننده محیط محسوب می­شود منجر به افزایش قابل توجه میزان تولید لاکتات کلسیم، بهره­وری و بازده واکنش می­شود.

   در هنگامی که از گلوکز به جای لاکتوز استفاده شد، یعنی در محیط تولید به g/l 50 آب پنیر، g/l 80 گلوکز اضافه شد، در مدت زمان 44 ساعت  g/l75/108 لاکتات کلسیم تولید شد. در این شرایط بازده واکنش 83%  و بدون تغییر خاصی بود ولی بدلیل کاهش زمان تولید افزایش قابل توجهی در بهره­وری ( g/lh 47/2) مشاهده گردید (شکل1).

   پس از موفقیت تولید در فرمانتور 20 لیتر شرایط تولید اسید لاکتیک در فرمانتور همزن­دار STR با حجم 750  لیتر با دو شرایط کشت غیرمداوم و نیمه مداوم بررسی شد که در افزایش حجم با وجود اثرات ممانعتی انتقال جرم و حرارت با بهینه­سازی شرایط میزان راندمان به بهترین شرایط خود رسید. یعنی در شرایط غیرمداوم  g/l120 لاکتات کلسیم با بهره­وری  g/lh8/2 و بازده 92% و در کشت نیمه مداوم  g/l350 لاکتات کلسیم با بهره­وری  g/lh4/5 تولید شد. این شرایط قابل مقایسه است با تولید صنعتی، کمپانی  PURAC که با استفاده از سویهL. bulgaricus  در سال 34000 تن اسید لاکتیک به روش مداوم  (Continuous)تولید می­کند. کمپانی­های چینی متعددی با روش غیر پیوسته و با راندمان کم این محصول را تولید می­نمایند که بدیهی است افزایش راندمان از حالت غیر پیوسته به خوراک دهی نیمه پیوسته خود تأثیر بالایی در افزایش راندمان خواهد داشت Bray, 1998)).

   پس از انجام مرحله تخمیر، فرآیندهای بعد از تولید (Down Steam Processing) با آغاز مرحله جداسازی سلول از مایع تخمیر و تخلیص در حد نیمه صنعتی آغاز شد که در فرمانتور L 750 از حدود 100 لیتر مایع تخمیر نهایی دارای 350 گرم در لیتر لاکتات کلسیم، حدود 80 لیتر اسید لاکتیک 270 گرم در لیتر حاصل شد. جهت بررسی کیفیت و خلوص اسید لاکتیک تولید شده، از روش HPLC استفاده شد.

   همانگونه که در جدول شماره 3 ملاحظه می­شود اثر بازدارندگی لاکتات کلسیم بسیار کمتر از اسید لاکتیک است و این نکته باعث رشد بهتر سویه­های تخمیری در مواد غذایی حاوی کلسیم خواهد شد. افزودن این نمک جهت غنی­سازی کلسیم و در خمیر نان علاوه بر جلوگیری از رشد کلی فرم­ها، از طنابی شدن نان جلوگیری می­کند (Shelef, 1994).

    اثر بازدارندگی اسید لاکتیک در بسیاری موارد نظیر ترکیبات دیگری مثل نیتریت، نیترات، بنزوات می­باشد. البته باید توجه دشت که اثرات جانبی استفاده از هر ترکیب در مواد غذایی مختلف متفاوت است و جایگزینی اسید لاکتیک در مواد غذایی ممکن است که بر خواص دیگر آن حداقل تأثیر را داشته باشد. از طرف دیگر بی­خطر بودن و حداقل عوارض جانبی ما را به این نکته رهنمون می­سازد که می­توان با تأثیر همزمان این ماده (در حداقل غلظت) با نگه­دارنده­های دیگر، میزان مصرف نگه­دارنده­های مضر را تا حد ممکن کاهش داد Oh and Marshall, 1996)). از طرفی همانگونه که در مقدمه ذکر شد استفاده از اسید لاکتیک و نمک­های آن در بسیاری از فرآورده­ها لازم می­باشد. این اسید علاوه بر کاهش آلودگی میکروبی در بهبود طعم، بافت و قوام مواد لبنی نظیر پنیر نقش دارد. علاوه بر آن در کنترل آلودگی­های میکروبی مواد غذایی دریایی و گوشت، بخصوص آلودگی لیستریایی مؤثر می­باشد ( Mejlholm etal., 2010). در شکل 5 ملاحظه می­شود که این اسید به شدت ضریب رشد (Specific growth rate) میکروارگانیسم­ها را کاهش می­دهد. یعنی علاوه بر توان ممانعت از رشد میکروارگانیسم­ها، در غلظت­های کمتر ضریب رشد آنها را نیز کاهش و زمان تخمیر یک ماده غذایی را افزایش می­دهد. لازم به ذکر است که ضریب رشد مخصوص این سویه­های استاندارد که به عنوان سویه­های ارزیابی کننده مواد ضد رشد بکار می­روند، در عدم حضور ماده نگه­دارنده بخوبی منحنی رشد طبیعی باکتری­ها را نشان می­دهد، اما در حضور لاکتات کلسیم به شدت کاهش و در حضور اسید لاکتیک به سمت صفر میل می­کند. این اسید در محافظت گوشت، سبزیجات و ماهی­ها به کار می­رود. لاکتات­ها در مهار آلودگی­های بوتیریکی در فرآیند تخمیر، به تأخیر انداختن تولید سم در کلستریدیوم بوتیلینوم، کاهش آلودگی میکروارگانیسم­های هوازی در سوسیس تازه و همبرگر پخته و مهار لیستریا منوسیتوژنز در مرغ و گوشت گوساله پخته نقش دارند Giees, 1994; Shelef, 1994)). علاو بر این، اسید لاکتیک به سفیده تخم مرغ برای تنظیم pH در حد1/5-8/4، توزیع پروتئین در سفیده تخم مرغ و بصورت لاکتات کلسیم برای حفظ سختی برش­های سیب در طی فرآوری و جلوگیری از بی­رنگ شدن میوه­ها و سبزیجات و به عنوان عامل تشکیل دهنده ژله برای پکتین­های دمتیله، بهبود کیفیت شیر خشک، شیر کندانسه و فرآورده­های قنادی کاربرد دارد Giees, 1994; Shelef, 1994)). اداره کل غذا و داروی آمریکا(FAO)  مصرف لاکتات­ها را بصورت منفرد و یا همراه با افزودنی­های مجاز دیگر در گوشت و
 فرآورده­های آن تا 2 درصد، به عنوان تشدید کننده طعم تا 2 درصد و تا 8/4 درصد در فرآورده­های پروتئینی پخته شده که بصورت بسته­بندی غیرقابل نفوذ ارائه می­شود را مجاز می­داند. اسپری محلول 1-3 درصد آن برای ضد عفونی کردن سطح گوشت و کاهش بار میکروبی با وجود اثر منفی بر مزه توصیه شده است (Shelef, 1994).

   این مطالعه به خوبی روند تولید بیوتکنولوژی مواد بیولوژیکی نظیر نگه­دارنده­های شیمیایی و ارزیابی آن­ را نشان می­دهد و می­توان امیدوار بود با افزایش استفاده و جایگزینی افزودنی­های طبیعی و بی­خطر، نظیر اسیدهای آلی و املاح آنها، نیسین و غیره، امکان اقتصادی شدن تولید آنها در ایران نیز عملی گردد.

 

 

 

منابع

  • Anuradha, R., Suresh, A.K. and Venkatesh, K.V. (1999). Simultaneous saccharification and fermentation of starch to lactic acid. Process Biotechemistry, 35: 367-375.
  • Bergmeyer, H.B. (1974). Method of enzymatic analysis, D-glucose determination with glucose oxidase and peroxidase, 2nd Edition, wein heim: Ver lag chemie, 1205-1215.
  • Bizzari, N.S. (2003). Lactic acid, Its Salts and Esters. The Chemical Economics Handbook-SRI International
  • Bray, R. (1998). Lactic acid by fermentation, PEP (Process Economics Program) review, 96-7.
  • Bruno-Barcena, J.M., Ragout, A.L., Cordoba, P.R. and Sineriz, F. (1999). Continuous production of L (+)-lactic acid by Lactobacillus casei in two-stage systems. Applied Microbiology Biotechnology, 51: 316-324.
  • Fitzpatrick, J.J., Ahrens, M. and Smith, Sh. (2001). Effect of manganese on Lactobacillus casei fermentation to produce lactic acid from whey permeate. Process Biochemistry, 36: 671-675.
  • Gieese, J. (1994). Antimicrobials: Assuring food safety. Food Technology, 48(6): 102-110.
  • Hofvendahl, K. and Hahn-Hagerdal, B. (2000). Factors affecting the fermentative lactic acid production from renewable resources. Enzme and Microbial Technology, 26: 87-107.
  • John, H.L. (1996). Microbiol Production of lactic Acid. Advanced in Applied Microbiology, 4: 45-88.
    • Mirdamadi, S., Sadegi, H., Sharifi, N., Fallahpour, M., Mohseni, F. and Bakhtiari, M.R. (2002). Comparison of lactic acid isomers produced by fungal and bacterial strains. Iranian Biomedical journal,6(2-3): 69-75.
    • Mejlholm, O., Gunvig, A., Borggaard, C., Blom-Hanssen, J., Mellefont, L., Ross, T., Leroi, F., Else, T., Visser, D. and Dalgaard, P. (2010). Predicting growth rates and growth boundary of Listeria monocytogenes-An international validation study with focus on processed and ready-to-eat meat and seafood, International Journal of Food Microbiology, 141(3): 137-150.
    • Mirdamadi, S., Rajabi, A., Aziz Mohseni, F., Momen, B. (2007). Lactic acid Production by lactobacillus strains. Iranian Journal of Sciences and Food Technology, 2(3): 57-65.
    • Mirdamadi, S., Rajabi, A., Akbarzadeh, A. (2005). Batch and fed batch production of L (+) lactic acid. Journal of Biotechnology, 118: 106-107.
    • Mirdamadi, S., Atashgahi, S., Rajabi, A., Mohseni, F., Roayaei, M. and Hamedi, J. (2008). Cell entrapment of Lactobacillus casei subsp. casei ATCC 39392for lactic acid production. Irainian Journal of Biotechnology, 6(1): 18-21.
    • Mirdamadi, S., Agha Ghazvini, Sh., Taffresh, H. (2009). Production and nano-formulation of nisin in liposome as a slow release preservative against important food-born pathogens in Uf cheese. New Biotechnology, 25(1): 193.
    • Shelef, L.A. (1994). Antimicrobials effects of lactates: A review, Journal of Food Protection, 57(5): 445-450.
    • Tafreshi, S.H., Mirdamadi, S., Norouzian, D., Khatami, Sh. and Sardari,S. (2010). Effect of nonnutritional factors on nisin production. (2010). African Journal of Biotechnology, 9(9): 1382-1391.
    • Tafreshi, S.H., Mirdamadi, S., Norouzian, D., Khatami, Sh. and Sardari,S. (2010). Optimization of non-nutritional factors for a cost-effective enhancement of nisin production using orthogonal array method. Journal of Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2(4): 267-273
    • Zyed, G. and Winter, J. (1995). Batch and continuous production of lactic acid from salt whey using free and immobilized cultures of Lactobacilli. Applied Microbiology Biotechnology, 44: 362-366.

·    Oh, D.H. and Marshall, D.L. (1993). Antimicrobial activity of ethanol, glycerol monolaurate or lactic acid against Listeria monocytogenes. International Journal of Food Microbiology, 20(4): 239-246.

 

 

  • Anuradha, R., Suresh, A.K. and Venkatesh, K.V. (1999). Simultaneous saccharification and fermentation of starch to lactic acid. Process Biotechemistry, 35: 367-375.
  • Bergmeyer, H.B. (1974). Method of enzymatic analysis, D-glucose determination with glucose oxidase and peroxidase, 2nd Edition, wein heim: Ver lag chemie, 1205-1215.
  • Bizzari, N.S. (2003). Lactic acid, Its Salts and Esters. The Chemical Economics Handbook-SRI International
  • Bray, R. (1998). Lactic acid by fermentation, PEP (Process Economics Program) review, 96-7.
  • Bruno-Barcena, J.M., Ragout, A.L., Cordoba, P.R. and Sineriz, F. (1999). Continuous production of L (+)-lactic acid by Lactobacillus casei in two-stage systems. Applied Microbiology Biotechnology, 51: 316-324.
  • Fitzpatrick, J.J., Ahrens, M. and Smith, Sh. (2001). Effect of manganese on Lactobacillus casei fermentation to produce lactic acid from whey permeate. Process Biochemistry, 36: 671-675.
  • Gieese, J. (1994). Antimicrobials: Assuring food safety. Food Technology, 48(6): 102-110.
  • Hofvendahl, K. and Hahn-Hagerdal, B. (2000). Factors affecting the fermentative lactic acid production from renewable resources. Enzme and Microbial Technology, 26: 87-107.
  • John, H.L. (1996). Microbiol Production of lactic Acid. Advanced in Applied Microbiology, 4: 45-88.
    • Mirdamadi, S., Sadegi, H., Sharifi, N., Fallahpour, M., Mohseni, F. and Bakhtiari, M.R. (2002). Comparison of lactic acid isomers produced by fungal and bacterial strains. Iranian Biomedical journal,6(2-3): 69-75.
    • Mejlholm, O., Gunvig, A., Borggaard, C., Blom-Hanssen, J., Mellefont, L., Ross, T., Leroi, F., Else, T., Visser, D. and Dalgaard, P. (2010). Predicting growth rates and growth boundary of Listeria monocytogenes-An international validation study with focus on processed and ready-to-eat meat and seafood, International Journal of Food Microbiology, 141(3): 137-150.
    • Mirdamadi, S., Rajabi, A., Aziz Mohseni, F., Momen, B. (2007). Lactic acid Production by lactobacillus strains. Iranian Journal of Sciences and Food Technology, 2(3): 57-65.
    • Mirdamadi, S., Rajabi, A., Akbarzadeh, A. (2005). Batch and fed batch production of L (+) lactic acid. Journal of Biotechnology, 118: 106-107.
    • Mirdamadi, S., Atashgahi, S., Rajabi, A., Mohseni, F., Roayaei, M. and Hamedi, J. (2008). Cell entrapment of Lactobacillus casei subsp. casei ATCC 39392for lactic acid production. Irainian Journal of Biotechnology, 6(1): 18-21.
    • Mirdamadi, S., Agha Ghazvini, Sh., Taffresh, H. (2009). Production and nano-formulation of nisin in liposome as a slow release preservative against important food-born pathogens in Uf cheese. New Biotechnology, 25(1): 193.
    • Shelef, L.A. (1994). Antimicrobials effects of lactates: A review, Journal of Food Protection, 57(5): 445-450.
    • Tafreshi, S.H., Mirdamadi, S., Norouzian, D., Khatami, Sh. and Sardari,S. (2010). Effect of nonnutritional factors on nisin production. (2010). African Journal of Biotechnology, 9(9): 1382-1391.
    • Tafreshi, S.H., Mirdamadi, S., Norouzian, D., Khatami, Sh. and Sardari,S. (2010). Optimization of non-nutritional factors for a cost-effective enhancement of nisin production using orthogonal array method. Journal of Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2(4): 267-273

·    Oh, D.H. and Marshall, D.L. (1993). Antimicrobial activity of ethanol, glycerol monolaurate or lactic acid against Listeria monocytogenes. International Journal of Food Microbiology, 20(4): 239-246.

Zyed, G. and Winter, J. (1995). Batch and continuous production of lactic acid from salt whey using free and immobilized cultures of Lactobacilli. Applied Microbiology Biotechnology, 44: 362-366.