مطالعه مقایسه‌ای روش‌های کشت و PCR جهت تشخیص آلودگی شیر خام گاوهای به ظاهر سالم به مایکوباکتریوم اوویوم تحت گونه پاراتوبرکلوزیس

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسنده

دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، استادیار گروه پاتوبیولوژی، تبریز، ایران. مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز، تبریز، ایران.

چکیده

   مایکوباکتریوم اوویوم تحت گونه پاراتوبرکلوزیس عامل بیماری یون گاوی است که به عنوان یک بیماری‌های عفونی مزمن محسوب می‌شود. نکته مهم از نظر بهداشت مواد غذایی، نقش احتمالی این باکتری در ایجاد بیماری کرون در انسان می‌باشد. شیوع بالای آلودگی با این باکتری در گاوهای شیری در سرتاسر جهان گزارش‌ شده است. در این ارتباط تشخیص باکتری مذکور در شیر دام‌های سالم و مشکوک به آلودگی از مهم‌ترین اقدامات جهت جلوگیری از گسترش عفونت محسوب می‌شود. کشت در محیط اختصاصی به عنوان روش مرجع برای تشخیص این باکتری می‌باشد. اما در عین حال، روش PCRبا شناسایی میکروارگانیسم‌های کند رشد نظیر مایکوباکتریوم اوویوم تحت گونه پاراتوبرکلوزیس، این امکان را فراهم می‌کند تا در زمان بسیار کوتاه بتوان از این روش به عنوان یک آزمایش تشخیصی با حساسیت بالا استفاده کرد. لذا در پژوهش حاضر، آزمایش‌های کشت و PCR بر روی نمونه‌های خامه و رسوب شیر 160 رأس گاو شیری به ظاهر سالم، انجام گردید. با بررسی یافته‌های حاصله بر اساس آزمون آماری کاپا مشاهده گردید، توافق بین کشت و PCR با محصول bp 400تقریباً کامل، توافق بین کشت و PCR  با محصول bp228 اساسی و توافق بین دو آزمایش PCR با محصولات متفاوت ذکر شده هم اساسی برآورد گردید. در نهایت با مقایسه توافق بین دو آزمایش PCR استفاده شده در این پژوهش با روش کشت اختصاصی به عنوان آزمایش استاندارد طلایی تشخیص باکتری مذکور در نمونه‌ها، می‌توان اعلام کرد که آزمایش PCRمی‌تواند به عنوان یک روش سریع و دقیق جایگزینی مناسب به جای روش‌های متداول در تشخیص مایکوباکتریوم اوویوم تحت گونه پاراتوبرکلوزیس علی‌الخصوص به‌عنوان یک آزمایش غربالگری در مورد نمونه شیر گاوها مطرح شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Comparison of culture and PCR methods for detection of Mycobacteriumavium subsp. paratuberculosis in raw milk of apparently healthy cattle

نویسنده [English]

  • Y Anzabi
Department of Pathobiology, ‍College of Veterinary Medicine, Tabriz Branch, Islamic Azad University, Tabriz, Iran Biotechnology Research Center, Tabriz Branch, Islamic Azad University, Tabriz, Iran.
چکیده [English]

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis is the etiological agent for Johne’s disease which is known as chronic disease in cattle and may attribute to Crohn’s disease in human. High prevalence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis has been reported in dairy cattle worldwide. Recognition of infected animals is a major factor to control the spread of the organism. In this regard, detection of the bacterium in milk of clinically suspicious and apparently healthy cows is the best way to control the infection. Although isolation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis by culture assay is considered as the gold standard, PCR method helps us to recognize the occurrence of slow-growing microorganisms in a short period of time with high sensitivity. In this survey, a total number of 160 cow milk was sampled and cream layer together with the pellet of each sample was tested by PCR and culture technique. Using Kappa statistics it was revealed an almost perfectagreement between culture and PCR assay with a product size of 400 bp; however, the agreement between culture and PCR with product size of 228 bp was found substantial. Results showed a substantial agreement between PCR with product sizes of 400 bp and 228 bp. Comparing the agreement between the two PCR approaches with culture assay as gold standard test, it was assumed that PCR could be a robust and rapid method to detect Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in milk. Consequently, PCR can be introduced as a screening test for detection of the bacterium in cow milk.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis
  • Johne’s disease
  • Crohn's disease
  • Cow milk
  • culture
  • PCR

مقدمه

   بیماری یون یا Paratuberculosis از جمله بیماری‌های عفونی مزمن و مهم از نظر اقتصادی است که گریبان‌گیر صنعت گاوداری می‌باشد. این بیماری غیرقابل درمان، به صورت آنتروکولیت گرانولوماتوز، لنفادنیت و تورم عروق لنفاوی موضعی ظاهر می‌شود که علامت شاخص این بیماری کاهش وزن پیش‌رونده و کاهش تولید شیر دام می‌باشد. عامل مسبب بیماری که قرابت زیادی با مایکوباکتریوم اویوم دارد در نامگذاری جدید به عنوان تحت گونه اویوم یعنی Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ‌خوانده می‌شود (حسنی طباطبائی و  فیروزی، 1380؛Lilenbaum et al., 2007).

   بیماری یون انتشار جهانی دارد و شیوع آن در کشورها در حال افزایش است. طبق بررسی‌های سازمان دامپزشکی، وجود بیماری مذکور در اغلب استان‌های کشورمان به اثبات رسیده است. هم‌چنین در گزارش‌های مختلف، شیوع بالاتری از این بیماری در گاوهای شیری نسبت به گاوهای گوشتی ذکر شده است. در ایران نیز شیوع بالای این باکتری در شیرهای خام و پاستوریزه گزارش گردیده است (خاکپور و همکاران، 1390؛  Botsaris et al., 2010; Anzabi and Hanifian, 2012)

   در بیماری مذکور منبع اصلی عفونت، مدفوع دام‌های آلوده بوده و تماس نزدیک دام مستعد با مدفوع آلوده یک عامل مهم در شیوع بیماری است. بر همین اساس به‌نظر می‌رسد که انتقال بیماری در شرایط طبیعی، در اثر خوردن آب و غذای آلوده به مدفوع دام آلوده صورت می‌گیرد. البته نکته مهم در این خصوص توجه به این مسأله است که دوره کمون طولانی (2 سال یا بیشتر) باعث می‌شود که دفع باکتری از دام آلوده، از حدود 18 ماه قبل از بروز علایم آشکار وجود داشته باشد. آلودگی سر پستان با مدفوع و حضور آن در آغوز و شیر ممکن است منجر به بلع جرم به میزان زیاد توسط گوساله گردد (انزابی و همکاران، 1387؛ خاکپور و همکاران،1390؛ Grant et al., 2010) 

   با توجه به این نکته که اسهال مزمن و مقاوم به درمان از علایم بارز این بیماری است و این مسأله می‌تواند موجب آلودگی شیر و محیط دامداری‌ها گردد. بر همین اساس مطالعات انجام یافته در این مورد هم حاکی از افزایش احتمال آلودگی ثانویه شیر به هنگام شیر دوشی دستی می‌باشد (Hanifian et al., 2013). البته این مشکل زمانی پیچیده‌تر خواهد شد که در یک گاوداری از شیرهای به ظاهر غیرآلوده دام‌های مذکور برای تغذیه سایر گوساله‌ها نیز استفاده شود Okura et al., 2012) Eltholth et al., 2009; Fathi et al., 2011;).

   نکته مهم در رابطه با مایکوباکتریوم اوویومپاراتوبرکلوزیس، نقش احتمالی این باکتری در ایجاد بیماری کرون در انسان  (Crohn's  disease) می‌باشد. به‌طوریکه در بررسی‌های مختلف از افراد مبتلا به بیماری کرون باکتری مذکور جداسازی و شناسایی شده و نیز اکثر آنتی بیوتیک‌هایی که در مورد بیماری کرون مؤثر بوده است همان ترکیباتی می‌باشد که بر علیه باکتری مایکوباکتریوم اوویومپاراتوبرکلوزیس هم مورد استفاده قرار گرفته است. از طرف دیگر شباهت‌های موجود در علایم بالینی و نیز علایم کالبدگشایی بیماری یون و کرون، نقش احتمالی باکتری فوق در اتیولوژی بیماری کرون را قوت بخشیده است. لذا در بسیاری از پژوهش‌های مرتبط، باکتری مذکور به‌عنوان یک مخاطره بهداشتی در سلامت عمومی انسان‌ها مطرح شده است ( Fellows et al., 1990; Anadolu et al., 1999; Harris and Barletta, 2001; Rodreguez-Lazaro, et al., 2005; Klanicova et al., 2012 ).

   با توجه به مطالب ذکر شده به نظر می‌رسد که شناسایی دام‌های دفع‌کننده فاقد علایم بیماری و بدون عفونت‌های آشکار مهم‌ترین کار در کنترل بیماری مذکور در دام‌ها و احتمالاً پیشگیری از بیماری کرون در انسان خواهد بود که به این منظور کشت نمونه‌ها بهترین روش جداسازی و شناسایی مایکوباکتریوم اوویوم پاراتوبرکلوزیس می‌باشد. اما در این بین استفاده از روش تشخیصی PCR در مقابل روش کشت باکتریایی این اجازه را می‌دهد که با امکان شناسایی میکروارگانیسم‌های کند رشد نظیر عامل بیماری یون، در زمان بسیار کوتاه و به شکل سریع بتوان از این روش مولکولی به عنوان یک آزمایش تشخیصی با حساسیت بالا استفاده کرد (Chiodini, 1990; Englund et al., 1999; Haghkhah et al., 2008).

   لذا بر اساس مطالب فوق، هدف این پژوهش آزمایش‌ PCR و کشت نمونه‌های شیر گاوهای به ظاهر سالم بود تا با مقایسه نتایج حاصل، روشی سریع و دقیق برای مشخص کردن آلودگی شیر گاو به مایکوباکتریوم اوویوم پاراتوبرکلوزیس معرفی گردد.      

 

مواد وروش‌ها

نمونه‌برداری

   در این تحقیق با مراجعه به 8 گاوداری صنعتی اطراف شهر تبریز که اولاً تعداد گاوهای دوشای تقریبا یکسان داشته و ثانیاً سابقه بیماری یون در پرونده بهداشتی گاوهایشان در گذشته ثبت گردیده بود، به روش تصادفی ساده از هر گاوداری 20 نمونه شیر از گاوهای به ظاهر سالم اخذ گردید.

روش آزمایش

   بر روی تمامی نمونه‌های شیر، ابتدا دو آزمایش PCR با استفاده از 2 جفت پرایمر اختصاصی مربوط به عنصر IS900 ژنوم باکتری مایکوباکتریوم اوویوم تحت گونه پاراتوبرکلوزیس انجام گردید. سپس در مورد هر نمونه شیری که به هر کدام از آزمایشات PCR جواب مثبت داد، آزمایش کشت اختصاصی به منظور جداسازی باکتری مذکور انجام گرفت.

استخراج DNA از جدایه‌ها

   به منظور استخراجDNA  باکتری عامل بیماری یون از نمونه‌ها بر مبنای روش سدیم دودسیل سولفات(SDS)، CTAB/NaCl و پروتئینازK بشرح زیرعمل شد:

   ابتدا مقدار کافی از نمونه‌ها (رسوب و خامة شیرهای مورد آزمایش که با انجام سانتریفوژ در شتاب g3000 به مدت 15 دقیقه، بدست آمده بودند) به 300 میکرولیتر از بافر 1XTE موجود در میکروتیوب‌های استریل منتقل شد. سپس برای غیرفعال کردن باکتری‌ها، میکروتیوب‌های مذکور به مدت بیست دقیقه در 80 درجه سلسیوس قرار داده شد. در ادامه  µl50 از لیزوزیم 10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر به میکروتیوب‌ها اضافه و تکان داده شده و برای حصول نتیجه بهتر به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس گرمخانه‌گذاری شدند. سپس µl 60 از محلول 10% SDS و همچنینµl  8 از پروتئیناز K به میکروتیوب‌ها اضافه شده و پس از هم‌زدن به صورت over night در دمای 60 درجه سلسیوس انکوبه گردید. در ادامه کار µl100 از محلول کلریدسدیم 5 مولار و µl80 از محلول CTAB/NaCl به میکروتیوب‌ها اضافه و تکان داده شد تا محلول شیری رنگ مشاهده گردد. سپس در این حالت میکروتیوب‌ها به مدت ده ‌دقیقه در دمای 65 درجه سلسیوس گرمخانه‌گذاری شد. در ادامه µl 700 از محلول chloroform/isoamylalchol به میکروتیوب‌ها اضافه کرده و به طور مختصر تکان داده و سپس به مدت هشت دقیقه در شتاب g 11000 سانتریفوژ گردید. پس از پایان سانتریفوژ، مایع رویی به میکروتیوب‌های تازه منتقل و سپس 6/0 حجم (حدودµl 420) ایزوپروپانول اضافه شده و به منظور مخلوط کردن، میکروتیوب‌ها به آرامی سروته گردید. پس از مدتی اسیدهای‌نوکلئیک در میکروتیوب‌ها ظاهر گردید، که در این حالت به فریزر 20- درجه سلسیوس منتقل و حدود سی دقیقه در این دما نگه‌داری شدند. در ادامه میکروتیوب‌ها در شتاب g 12000 به مدت پانزده دقیقه سانتریفوژ و سپس مایع رویی بیرون ریخته شده و حدود 1 میلی‌لیتر اتانول 70% سرد شده در فریزر برروی رسوب‌ها اضافه و در ادامه به آرامی سه بار سروته گردیده و دوباره درشتاب g 12000 به مدت پنج دقیقه سانتریفوژ شدند. پس از اتمام سانتریفوژ، اتانول بیرون ریخته شد و رسوب‌ها در دمای اتاق خشک گردید. در نهایتµl 100 از بافر 1XTE بر روی رسوب‌ها (حاوی DNA  استخراجی) اضافه و در 20- درجه سلسیوس نگه‌داری شد (خاکپور و همکاران،1390؛Supply et al., 2001; Sola et al., 2003).

پرایمرهای مورد استفاده برای انجام PCR

   با استفاده از مقالات موجود و با مراجعه به بانک ژنی و بررسی سکانس IS900 کروموزوم باکتری مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه پاراتوبرکلوزیس 2 جفت پرایمر به شرح زیر و از طریق سفارش به شرکت طوبی نگین تهران (تهران – ایران) تهیه و استفاده گردید (Pillai and Jayarao, 2002; Bhide et al., 2005):

 

 F-90: GTT-CGG-GGC-CGT-CGC-TTA-GG

R-91: GAG-GTC-GAT-CGC-CCA-CGT-GA

FP-25: CCA-GGG-ACG-TCG-GGT-ATG-GC

RP-26: GGT-CGG-CCT-TAC-CGG-CGT-CC

 

برنامه‌های مورد استفاده جهت انجام PCR

   مخلوط واکنش PCR شامل 1 میکرولیتر از هر یک از پرایمرهای F-90 و R-91 (با غلظت 5/0 میکرومولار)، DNA الگو به میزان 5 میکرولیتر (100 نانوگرم) و آنزیم  DNA Taqپلی‌مراز (5 واحد در میکرولیتر) به میزان 4/0 میکرولیتر که به همراه مخلوط بازهای آلی سه فسفاته (10 میکرو مولار) به مقدار 1 میکرولیتر و کلریدمنیزیوم (50 میکرو مولار) به مقدار 5/2 میکرولیتر و با اضافه کردن 5 میکرولیتر از بافر 10X  PCR و نیز 1/34 میکرولیتر آب مقطر دیونیزه استریل بود. تمامی مواد PCR از شرکت طوبی نگین تهران تهیه گردید. واکنش با حجم نهائی 50 میکرولیتر به میکروتیوب‌های استریل انتقال یافت. شرایط دمایی ترمال سایکلر (Eppendorf, Germany) عبارت بود از یک سیکل با دمای 94 درجه سلسیوس به مدت 5 دقیقه (دناتوراسیوناولیه)، 35 سیکل شامل 94 درجه سلسیوس به مدت 40 ثانیه (دناتوراسیون)، 65  درجه سلسیوس به مدت یک دقیقه (اتصال پرایمرها) و دمای 72 درجه سلسیوس به مدت یک دقیقه (برای عمل توسعه). بالاخره برای توسعه نهایی یک سیکل دمای 72 درجه سلسیوس به مدت 7 دقیقه استفاده گردید. طی روند PCR و اعمال برنامه دمایی و زمانی فوق، قطعه‌ای به اندازه bp400 تکثیر داده ‌شد که در عمل الکتروفورز با مقدار µl 5/7 از محصول PCR و در آگاروز 1% باند آن مشخص ‌گردید که با استفاده از دستگاه ژل داکیومنت عکس آنها تهیه شد. نمونه‌ای از این محصول در شکل 1 نشان داده شده است.

   از طرف دیگر برنامه مورد استفاده با پرایمرهای FP-25 و RP-26  نیزدر دستگاه ترمال سایکلر در مراحل مختلف آزمایش  PCRبه این صورت بود که در سیکل اول برای انجام عمل دناتوراسیونبه مدت 4 دقیقه دمای 94 درجه سلسیوس بر روی نمونه‌ها اعمال گردید. هم‌چنین در سیکل‌های اصلی هم که 35 بار تکرار شدند، جهت انجام عمل مذکور از همان دما ولی به مدت 30 ثانیه و برای اتصال از دمای 70  درجه سلسیوس طی همان مدت زمان و برای عمل توسعه هم از دمای 72 درجه سلسیوس به مدت 40 ثانیه استفاده شد. بالاخره در سیکل آخر هم برای توسعه نهایی محصول آزمایشPCR ، از همان دما در مدت 7 دقیقه استفاده گردید. برنامه مذکور هم با استفاده از مقدار 1 میکرولیتر از هر یک از پرایمرهای FP-25  و RP-26  (با غلظت 5/0 میکرومولار) و DNA استخراجی الگو  به میزان 6 میکرولیتر (100 نانوگرم) و آنزیم  DNA Taqپلی‌مراز (5 واحد در میکرولیتر) به میزان 4/0 میکرولیتر که به همراه دیگر اجزای آزمایش یعنی مخلوط بازهای آلی سه فسفاته (10 میکرو مولار) به مقدار 5/0 میکرولیترو کلرید منیزیوم (50 میکرو مولار) به مقدار 5/1 میکرولیتر و با اضافه کردن 5 میکرولیتر از بافر 10X  PCR و نیز 6/34 میکرولیتر آب مقطر دیونیزه استریل، که همگی از شرکت طوبی نگین تهران تهیه شده بود، با حجم نهائی 50 میکرولیتر در میکروتیوب‌های استریل ریخته شده و در میکروپلیت مخصوص دستگاه ترمال سایکلر شرکت (Eppendorf – Germany) قرار داده شد. مطابق برنامه مذکور نیز در طی روند PCR قطعه‌ای به اندازه bp 228 تکثیر داده ‌شد که در عمل الکتروفورز با مقدار µl 5/7 از محصول PCR و در آگاروز 2/1% باند آن مشخص ‌گردید که با استفاده از دستگاه ژل داکیومنت عکس آنها نیز تهیه شد که نمونه‌ای از آن هم در شکل شماره 1 نشان داده شده است (انزابی و همکاران، 1384؛ خاکپور و همکاران،1390).

کشت اختصاصی نمونه‌ها 

   بدین منظور نمونه‌های شیر که در ظروف 50 میلی‌لیتری استریل اخذ شده بود در شتاب g3000 به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ شده و سپس، عمل آلوده‌زدایی هم بر روی رسوب و هم برروی خامه حاصله بطور جداگانه با استفاده از محلول 75/0 %HPC (هگزا دو سیل پریدنیوم کلراید) (Merck-Germany) استریل تازه تهیه شده انجام گرفت (Dundee et al., 2001). سپس محتویات آلوده‌زدایی شده هر کدام از لوله‌های مذکور‌ را بار دیگر در شتاب g4000 به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ و مایع رویی را خالی شد و رسوب حاصله را ابتدا در 5/2 میلی‌لیتر PBS-T مخلوط و پس از کنترل pH و مخلوط کردن به منظور یکنواخت‌سازی کامل آن‌ها، هر نمونه آماده به 4 قسمت مساوی تقسیم و تحت شرایط استریل به 4 محیط کشت هرولد حاوی زرده تخم‌مرغ که قبلاً در لوله‌های آزمایش نسبتاً بلند بصورت مورب و در شرایط کاملا استریل تهیه شده بود انتقال یافت. لازم به ذکر است 3 عدد از محیط‌های مذکور حاوی ml1000/ mg2 مایکوباکتین و یک محیط هم بدون مایکوباکتین بود (Gilmour and  G.L. Wood, 1996; Whittington et al., 1999). همچنین برای جلوگیری از آلودگی ثانویه نمونه‌ها در طی دوره طولانی مدت انکوباسیون، به محیط‌های کشت مذکور آنتی‌بیوتیک‌های زیر (Sigma-Aldrich, USA) اضافه گردید: کاربینیسیلین (50 میکروگرم در میلی‌لیتر)، تری‌متوپریم (20 میکروگرم در میلی‌لیتر)، پلی‌میکسین B (200 واحد در میلی‌لیتر) و آمفوتریسین  B(10 میکروگرم در میلی‌لیتر). در نهایت انکوباسیون محیط کشت‌های فوق در شرایط هوازی و دمای 37 درجه سلسیوس و به مدت 16- 24 هفته انجام گردید (Gilmour and  G.LWood, 1996; Whittington et al., 1999).

آنالیز آماری

   با توجه به اینکه هدف اصلی از انجام تحقیق حاضر، مقایسه توافق (agreement) روش کشت به عنوان آزمایش استاندارد طلایی (Gold Standard) تشخیص باکتری عامل بیماری یون و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) به عنوان روشی سریع و اختصاصی به این منظور و در نتیجه معرفی آزمایشی مناسب و کارا برای تشخیص باکتری مذکور در نمونه‌ها بود،  لذا بدین منظور از روش آماری تطابقی کاپا (Kappa test) در این خصوص استفاده گردید.

 

یافته‌ها

   نتیجه آزمایش  PCRدر مورد خامه نمونه‌های شیر با محصول 228 bp شامل 18 نمونه مثبت بود (25/11 % موارد)، در حالیکه وقتی همین آزمایش بر روی رسوب نمونه‌ها انجام گردید، فقط تعداد 6 نمونه (83/3%) مثبت بودند. جالب اینکه در کشت اختصاصی نمونه‌های مذکور در محیط کشت جامد هرولد حاوی زرده تخم مرغ تعداد 8 نمونه مثبت مشاهده شد که شامل 5 % از کل شیرهای مورد آزمایش می‌باشد. اما در آزمایش PCR با محصول bp 400 در مورد خامه شیرهای مذکور فقط تعداد 12مورد مثبت مشاهده شد (5/7% نمونه‌ها) و این در حالی‌است که وقتی رسوب همین نمونه‌ها با همان آزمایش بررسی شد باز هم فقط 6 نمونه مثبت بود (83/3%). هم‌چنین در کشت اختصاصی رسوب نمونه‌های مذکور در محیط کشت جامد هرولد حاوی زرده تخم مرغ نیز تعداد 6 نمونه (83/3%) مثبت مشاهده شد.

   همچنین بر مبنای آزمون آماری کاپا (Kappa test)، توافق (agreement) بین کشت و PCR با محصول 400 bp ،تقریباً کامل (almost perfect) می‌باشد چرا که در این مورد K= 0.86 محاسبه گردید. اما باتوجه به اینکه در مورد توافق بین کشت و PCR با محصول 228 bp، نتیجه آزمون آماری مذکور نشان داد کهK = 0.62  می‌باشد، لذا توافق بین دو آزمایش مذکور اساسی (substantial) می‌باشد و بالاخره توافق بین PCR با محصول 400 bp  و PCR با محصول 228 bp نیز بر مبنای اینکه K= 0.75   محاسبه گردیده، اساسی (substantial) می‌باشد.

 

 

 

 

 

 

 

شکل1- ژل الکتروفورز شده آزمایشات PCR که در آن ردیف سوم DNA استخراجی و ردیف‌های 2و4 محصول bp400 PCR و ردیف‌های 6، 7، 8 محصول  bp228 PCR و ردیف پنجم نیز یک نمونه منفی و همچنین ردیف‌های اول و نهم، دو نوع سایزمارکر bp100 شرکت  Fermentas  (Germany) را نشان می‌دهند.

 


بحث و نتیجه‌گیری

   با پیشرفت روش‌های تشخیص مولکولی از جمله تکنیک PCR اهمیت و ارزش استفاده از آن‌ها در تشخیص انواع بیماری‌ها روز به روز بیشتر شده که این امر در ارتباط با تشخیص بیماری یون نیز به اثبات رسیده است، بطوریکه در مطالعات متعدد استفاده از آزمایش PCR در مقایسه با سایر روش‌ها تعداد جواب‌های مثبت بیشتری را نشان داده و نیز حساسیت بالا و ویژگی مناسب این تکنیک را در تشخیص بیماری یون توصیف کرده است. مثلا پژوهشی که در سال 1390 در منطقه مغان توسط خاکپور و همکاران و با مقایسه نتایج حاصله از آزمایش مستقیم میکروسکوپیک وPCR  انجام گرفته است، حساسیت بالای روش PCR را نشان داده است (خاکپور و همکاران،1390). البته نتایج تحقیق حاضر هم این امر را در مورد شیر دام‌های به ظاهر سالم  نشان می‌دهد. هم‌چنین در این رابطه در پژوهش دیگری در سال 2007 در هند، سه آزمایش تشخیصی الایزا، کشت و PCR بشکل مقایسه‌ای بر روی شیر گاوهای بومی انجام گرفته که در میان آنها روش PCR شیر بهترین نتایج را نشان داده است. در پژوهش مذکور نیز مشابه پژوهش حاضر هم از رسوب و هم از خامه شیر برای استخراجDNA  باکتری عامل بیماری یون استفاده شده است که در مقایسه نتایج، استفاده از رسوب (با 62% نتایج مثبت) نسبت به خامه (با حدود 50% نتایج مثبت) ارجح‌تر گزارش شده است (Sharma et al., 2007). اما نتایج پژوهش حاضر با این مورد ذکر شده متفاوت می‌باشد چرا که در مورد نمونه‌های خامه شیر 25/11 % مورد مثبت با استفاده از PCR با محصول bp  228 و در مورد PCR با محصول bp 400 فقط 5/7 % مورد مثبت مشاهده شد و این در حالیست که در خصوص رسوب شیر نتیجه بدست آمده در هردو آزمایش PCR یکسان بوده و فقط 83/3 % نمونه‌ها به این دو آزمایش جواب مثبت دادند. در این خصوص بنظر می‌رسد که به دلیل وجود چربی بیشتر در قسمت خامه شیر، باکتری مذکور به این بخش شیر تمایل بیشتری دارد. بطوریکه در ارتباط با این موضوع، حتی پژوهشی نشان داده است که عدم توجه به این موضوع می‌تواند به از دست رفتن بسیاری از میکروارگانیسم‌ها در قسمت خامه شیر در هنگام سانتریفوژ نمونه‌ها منجر شود که این مسئله بر جواب آزمایش‌های مذکور می‌تواند موثر باشد (Pillai and Jayarao, 2002).از طرف دیگر در پژوهشی که در سال 2004 در هندوستان بر روی گاومیش‌های آبی که دارای علائم بالینی بیماری یون بوده‌اند انجام گرفته است نشان داده شده که از مجموع 20 نمونه مربوط به دام‌های مذکور تعداد 14 نمونه به آزمایش تشخیصی PCR و فقط 6 نمونه به کشت اختصاصی جواب مثبت داده‌اند (Sivakumar et al., 2004) که نتایج پژوهش حاضر هم این مهم را مخصوصا در مورد خامه شیر دام‌های به ظاهر سالم بخوبی نشان می‌دهد (18 مورد مثبت با استفاده از PCR با محصول 228 bp و12 مورد مثبت با استفاده از  PCRبا محصول 400 bp، در حالیکه در کشت اختصاصی فقط 8 مورد مثبت مشاهده شد).

   اما در پژوهشی که در سال 2003 در ایتالیا انجام گرفته است، ابتدا گوسفندان با آزمایشی سرولوژیکی مورد مطالعه قرار گرفته و در ادامه نمونه‌های مثبت و منفی از نظر سرولوژیکی، از طریق PCR شیر آزمایش شدند که نتیجه این بوده که تعداد 9 نمونه مربوط به 15 دام سرم مثبت و نیز تعداد 4 نمونه از 14 دام سرم منفی به آزمایش PCR شیر جواب مثبت داده‌اند (Nebbia et al., 2003).

   ساین و همکاران نیز در مطالعه‌ای در سال 2007 با بررسی حساسیت الایزای شیر،PCR- IS900  شیر، کشت مدفوع و کشت شیر در مورد نمونه‌های مربوط به گوسفندان و بزها، نشان دادند که حساسیت روش‌های مذکور به ترتیب 4/88 % ، 23% ، 6/84% و 1/96% می‌باشد (Singh et al., 2007). که نتایج تحقیقات مذکور در مورد PCR شیر با نتایج تحقیق حاضر مقداری متفاوت می‌باشد که یکی از علل آن می‌تواند مربوط به تفاوت سن دام‌هائی باشد که از آنها نمونه‌گیری شده است. در این خصوص، عقیده بر این است که چون بیماری یون غالبا بشکل مزمن دیده می‌شود لذا تفاوت در سن دام‌هایی که از آنها نمونه گرفته می‌شود در نتیجه آزمایشات موثر است (Slana et al., 2008; Diegues et al., 2007). همچنین شواهد حاکی از آن است که حجم نمونه نیز در این مورد می‌تواند موثر باشد. از طرف دیگر عقیده بر این است که وجود متابولیت‌هائی شبیه یون‌های کلسیم در نمونه‌های شیر ممکن است که واکنش PCR را مهار کرده و لذا نتایج متفاوت حاصل شود (Millar et al., 1996; Englund et al., 1999; Singh et al., 2007).

همچنین با توجه به اینکه دفع باکتری عامل بیماری یون از طریق شیر در عین اینکه به مقدار بسیار کم بوده، همچنین حالت متناوب هم دارد لذا ممکن است که در زمان جمع‌آوری نمونه‌های شیر برای آزمایش، باکتری مذکور در شیر وجود نداشته و نتیجه آزمایش بشکل کاذب منفی درآید (انزابی و همکاران، 1384؛ Wells et al., 2006).

   بنظر می‌رسد که یکی دیگر از دلایل عدم هم‌خوانی نتایج پژوهش حاضر با  نتایج حاصله در برخی از تحقیقات مشابه که در بالا به آنها اشاره شد